硫化氢对大鼠糖尿病心肌病氧化应激及内质网应激的影响*

杨　锐， 贾　强， 刘小粉， 高　琴， 王　蕾， 马善峰

(蚌埠医学院生理学教研室， 安徽 蚌埠 233030)



硫化氢对大鼠糖尿病心肌病氧化应激及内质网应激的影响*

杨锐， 贾强， 刘小粉， 高琴， 王蕾， 马善峰△

(蚌埠医学院生理学教研室， 安徽 蚌埠 233030)

目的：观察外源性给予硫化氢(H2S)供体硫氢化钠(NaHS)对大鼠糖尿病心肌病氧化应激作用以及内质网应激相关因子表达的影响。方法：将30只雄性SD大鼠随机分为对照组、糖尿病组和治疗组(n=10)。采用腹腔注射链脲佐菌素的方法制备大鼠糖尿病模型，治疗组采用腹腔注射给予NaHS干预治疗。12周后，利用离体心脏灌流装置测定心室动力学指标；透射电镜观察心肌细胞超微结构变化；测定心肌组织脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性； RT-PCR检测C/EBP 同源蛋白(CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和半胱天冬蛋白酶12(Caspase 12)基因表达。 结果：与对照组比较，糖尿病组心功能明显降低、心肌超微结构损伤明显，心肌组织MDA含量增加、SOD和GSH-Px的活性明显降低，CHOP、GRP78和Caspase 12 mRNA表达明显增加。与糖尿病组比较，治疗组心功能和心肌超微结构损伤明显改善，心肌组织MDA含量下降，SOD和GSH-Px的活性明显升高，CHOP、GRP78和Caspase 12 mRNA表达明显下降。结论：外源性补充H2S对糖尿病大鼠心肌病具有保护作用，机制可能与减轻氧化应激损伤和抑制内质网应激引发的凋亡作用有关。

硫化氢；糖尿病心肌病；大鼠；氧化应激；内质网应激

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病并发的特异性心肌病，表现为心肌肥厚、心肌纤维化，心脏收缩和舒张功能全面下降，易并发心力衰竭及心律失常，是糖尿病严重的并发症[1]。其发生机制至今尚未完全阐明，但有很多证据显示与氧化应激作用及细胞凋亡作用相关[2,3]。氧化应激作用是由于体内的促氧化作用大于抗氧化作用而引发的损伤。近年来发现，内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)可以介导细胞的凋亡[4]，葡萄糖调节蛋白78(glucose- regulated protein 78，GRP78)是ERS的经典标志物，当ERS发生时，GRP78蛋白大量表达，并激活C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)和半胱天冬蛋白酶12(Caspase 12)的活化等，引起细胞的程序性死亡[5]。

硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)是新型第三种气体信号分子，并参与心血管系统生理功能的调控[6]。目前已发现外源性补充H2S的供体硫氢化钠(sodium hydrosulfide, NaHS)可以减轻氧化应激损伤以及抗心肌细胞凋亡的作用[7,8]，但是它在糖尿病心肌病氧化应激和ERS介导的凋亡中的作用尚不清楚。本实验通过建立大鼠糖尿病心肌病模型，研究H2S对大鼠糖尿病心肌病氧化应激以及ERS相关蛋白基因表达的影响，以进一步探讨H2S对糖尿病大鼠心肌病的保护机制是否与减轻氧化应激损伤和抑制ERS引发的凋亡作用有关。

1　材料与方法

1.1材料

链脲佐菌素(steptozotocin，STZ)和NaHS(美国Sigma公司)；丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；RNAiso Plus试剂和RT-PCR逆转录试剂盒(TaKaRa公司)；PCR试剂盒(Fermentas公司)；CHOP、GRP78、Caspase 12和GAPDH引物(上海生工生物工程股份有限公司)。所用CHOP引物：上游5’- GTG TTC CAG AAG GAA GTG CA -3’，下游5’- CTC CTG CAG ATC CTC ATA CC -3’，扩增产物长度为150 bp；GRP78引物：上游5’- CGC GCT CGA TAC TGG CTG TGA CTA -3’，下游5’- TTC ATC TTG CCG GCG CTG TG -3’，扩增产物长度为168 bp；Caspase 12引物：上游5’- TCA AAG CAG AGC CCT GTG TT -3’，下游5’- TGC AGG ATT CTT GGA CAT AA -3’，扩增产物长度为164 bp；GAPDH引物：上游5’- ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC -3’，下游5’- TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA -3’，扩增产物长度为452 bp。

1.2动物分组及处理

雄性SD大鼠30只(蚌埠医学院实验动物中心提供)，体重160～200 g，随机均分为对照组、糖尿病组和治疗组(n=10)。糖尿病组和治疗组大鼠空腹12 h后，一次性腹腔注射STZ 55 mg/kg，72 h后尾静脉采血测血糖浓度，血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病大鼠。治疗组在糖尿病动物模型建立成功后第5周起，腹腔注射NaHS溶液(使用前新鲜配制，浓度为10 mmol/L) 14 μmol/kg，体积1.4 ml/kg；对照组和糖尿病组腹腔注射同剂量生理盐水，每天1次，共持续8周。

1.3左心室功能评价

12周末，大鼠断头后取心脏，迅速将其固定在Langendorff灌流装置上。用95% O2+5% CO2的混合气饱和Krebs-Henseleit液，恒温(37℃)恒压(10.13 kPa)进行灌流。左心室舒张末压稳定在0.53 ～1.07 kPa之间[8]。MedLab生物信号采集处理系统记录左心室发展压(left ventricular developed pressure，LVDP)和左心室内压最大上升/下降速率(maximal rise/fall rate of left ventricular pressure，±dp/dtmax)等各项指标。

1.4心肌超微结构观察

取心肌，制成1 mm×1 mm×1 mm的组织块，放入2.5%戊二醛中固定，JEM-1230型透射电镜观察心肌超微结构。

1.5生化指标检测

取心肌组织严格按照试剂盒说明书操作，分别测定MDA含量、SOD和GSH-Px活性。

1.6RT-PCR检测CHOP、GRP78和Caspase 12 mRNA表达

采用RNAiso Plus试剂提取心肌组织总RNA。以总RNA为模板，根据反转录试剂盒要求反转录合成cDNA。以此cDNA为模板，进行PCR扩增。扩增条件：95℃预变性3 min后，以95℃ 变性50 s，CHOP退火温度54.9℃ 45 s，GRP78退火温度57.8℃ 45 s，Caspase 12退火温度53.3℃ 45 s，GAPDH退火温度54.7℃ 45 s；72℃ 50 s，反应32个循环，最后一轮72℃延伸10 min。取5 μl PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳。在GIS凝胶处理系统中拍摄，用电泳凝胶图像分析系统计算各目的基因与内参基因条带光密度比值(CHOP/GAPDH；GRP78/GAPDH；Caspase-12/GAPDH)表示mRNA相对表达量。

1.7统计学处理

2　结果

2.1左心室功能指标比较

与对照组比较，糖尿病组LVDP和±dp/dtmax明显降低(P<0.01)。外源性补充H2S后，治疗组LVDP和±dp/dtmax均显著升高(P<0.01，表1)。

GroupLVDP(kPa)+dp/dtmax(kPa/s)-dp/dtmax(kPa/s)Control10.22±1.66337.64±48.72189.67±34.33Diabe-tes4.32±1.18**152.90±35.79**74.65±26.07**Treat-ment6.75±1.46##234.45±34.48##125.33±29.49##

LVDP: Left ventricular developed pressure; ±dp/dtmax: Maximal rise/fall rate of left ventricular pressure

**P<0.01vscontrol group；?##P<0.01vsdiabetes group

2.2心肌超微结构变化

电镜下，对照组大鼠心肌细胞肌原纤维排列整齐、规则，胞浆内有丰富的线粒体，线粒体嵴密集、排列规则；糖尿病组大鼠心肌肌原纤维排列紊乱、断裂、甚至溶解，线粒体嵴模糊不清，有大量空泡产生；治疗组心肌损伤明显减轻，肌原纤维排列较整齐，部分线粒体嵴排列较规则，有少量空泡产生(图1)。

Fig. 1Transmission electron microscopy of myocardium in rats(×20 000)

A：Control group； B：Diabetes group； C：Treatment group

2.3心肌组织MDA含量、SOD和GSH-Px活性的检测

与对照组相比，糖尿病组MDA含量明显升高(P<0.01)，SOD和GSH-Px活性明显下降(P<0.01)；与糖尿病组比较，治疗组MDA含量明显下降(P<0.01)，SOD和GSH-Px活性明显升高(P<0.05，P<0.01，表2)。

GroupMDA(nmol/mgprot)SOD(U/mgprot)GSH-Px(U/mgprot)Control12.62±2.33182.31±17.34152.50±17.18Diabetes19.39±2.88**129.72±16.38**114.84±13.86**Treat-ment16.02±2.57##150.71±15.77##130.61±15.11#

MDA: Malondialdehyde; SOD: Superoxide dismutase; GSH-Px: Glutathione peroxidase

**P<0.01vscontrol group；?#P<0.05，##P<0.01vsdiabetes group

2.4心肌组织CHOP、GRP78和Caspase 12 mRNA的表达

与对照组比较，糖尿病组CHOP、GRP78和Caspase 12 mRNA表达水平明显升高(P<0.01)；与糖尿病组比较，治疗组CHOP、GRP78和Caspase 12 mRNA表达水平显著下降(P<0.01，表3，图2)。

GroupCHOP/GAPDHGRP78/GAPDHCaspase12/GAPDHControl0.27±0.080.28±0.090.26±0.07Diabetes0.63±0.11**0.71±0.12**0.69±0.14**Treat-ment0.42±0.09##0.57±0.11##0.52±0.13##

CHOP: C/EBP homologous protein; GRP78: Glucose regulated protein 78

**P<0.01vscontrol group；?##P<0.01vsdiabetes group

Fig. 2mRNA levels of CHOP, GRP78 and Caspase 12 in rats

M：Marker； 1：Control group； 2：Diabetes group； 3：Treatment group； CHOP: C/EBP homologous protein; GRP78: Glucose regulated protein 78

3　讨论

DCM是由糖尿病引起的心脏微血管病变、心肌代谢紊乱及纤维化等所导致的心肌结构异常，最终引起左心室肥厚、舒张期和(或)收缩期功能障碍的一种疾病。DCM的发病机制复杂，包括心肌细胞凋亡增多。目前能引起DCM心肌细胞凋亡的原因主要包括：高血糖、氧化应激、脂质代谢障碍等。STZ可以选择性破坏动物胰岛的β细胞，导致长期的胰岛素缺乏及血糖水平提升。通过给予大鼠一次性大剂量腹腔注射STZ制备1型糖尿病大鼠模型，糖尿病造模成功后4周，心肌损伤明显；8周，即为糖尿病心肌病[9]。随着糖尿病进程的持续发展，大鼠糖尿病组的左心室功能指标明显降低，心肌纤维排列紊乱，线粒体肿胀，心肌损伤严重。H2S被认为是调节心血管功能的内源性气体信号分子[6]。研究发现，内源性H2S对心肌组织具有保护作用[7,8,10]，心肌组织中适宜的H2S水平对维持心肌组织正常结构与功能具有重要调节作用。Su等[7]利用在体测定大鼠心功能的导管法，发现外源性给予H2S供体能够明显改善阿霉素心肌病大鼠的左心室功能。本实验利用离体心脏Langendorff灌流法也证实，外源性补充H2S的供体NaHS后，与糖尿病组相比，治疗组的左心室功能指标明显改善，LVDP和±dp/dtmax均明显升高，心肌超微结构损伤明显好转，提示H2S对大鼠糖尿病心肌损伤具有保护作用。

近年来研究发现，氧化应激在糖尿病及其并发症的发生和发展过程中起到重要作用[11]。氧化应激是指活性氧(reactive oxygen species, ROS)产生过多后导致组织细胞损伤[12]。而高血糖是产生氧化应激的主要原因，通过线粒体电子传递链途径增加机体ROS的含量。ROS是诱导体内发生氧化应激的主要物质，包括超氧阴离子、过氧化氢和羟基自由基等。当ROS产生速率超过其清除速率时就会产生氧化应激[13]。ROS与多不饱和脂肪酸反应的产物是脂质过氧化物，因此MDA的含量可以反映机体氧化应激损伤的程度。SOD和GSH-Px能够清除超氧产物，将其转化成氧气和水，因此是细胞内还原力水平的检测指标。近年来的研究发现，在阿霉素心肌病中，H2S可以增强清除氧自由基的能力、减少心肌细胞脂质过氧化物含量，从而起到保护心肌细胞的作用[7]。而在糖尿病心肌病中，H2S对氧化应激的作用尚未完全明了。本实验建立了糖尿病大鼠心肌病模型，结果显示：与正常组比较，糖尿病组心肌细胞中MDA含量明显升高，SOD和GSH-Px活性明显下降，说明糖尿病大鼠的心肌存在氧化应激损伤。外源性给予H2S后，治疗组心肌细胞MDA含量明显降低，SOD和GSH-Px活性明显升高，提示H2S可能通过提高心肌细胞中抗氧化酶活性，抑制ROS和脂质过氧化物生成，减轻氧化应激损伤，进而保护糖尿病的心肌组织。

内质网(endoplasmic reticulum, ER)是细胞内重要的细胞器，主要参与调节蛋白质合成以及合成后折叠等。病理刺激如氧化应激，脂质积聚等都会影响内质网的正常生理功能[14]，引起未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网的聚集，引起内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)。内质网通过激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response， UPR)来保护由ERS引起的损伤，如果损伤严重，ERS可以启动凋亡程序，而ERS启动的凋亡是经一种新的途径，不同于以往熟知的死亡受体及线粒体途径[5]。ER定位分子伴侣GRP78是ERS的经典标志物，UPR可以上调GRP78的表达，有助于修复蛋白质的折叠。但若ERS长时间持续时，会通过促进CHOP的转录诱导[15]， Caspase 12依赖途径及激活c-Jun氨基末端激酶依赖途径等启动细胞凋亡过程。我们的研究发现，与对照组比较，糖尿病组大鼠的心肌组织中GRP78、CHOP和Caspase 12 mRNA表达水平明显增加，提示ERS可能参与了糖尿病大鼠的心肌细胞凋亡，在糖尿病心肌病的发展中起重要作用。外源性补充H2S后，与糖尿病组相比，治疗组心肌组织中GRP78、CHOP和Caspase 12 mRNA表达水平明显下降，提示H2S可能通过以下3种机制抑制ERS：(1)下调GRP78的表达，抑制CHOP的转录；(2)抑制Caspase 12的激活，继而抑制下游的Caspase家族成员的激活，抑制心肌细胞凋亡；(3)提高抗氧化酶活性，减少ROS和脂质过氧化物生成，降低未折叠或错误折叠蛋白在内质网的积聚，从而抑制ERS。因此，可以得出结论，H2S可以通过减轻氧化应激损伤和抑制ERS，改善糖尿病大鼠的心功能和心肌超微结构，保护糖尿病大鼠的心肌组织。

综上所述，外源性H2S可能是通过减轻大鼠糖尿病心肌病氧化应激损伤，以及抑制内质网应激启动的细胞凋亡途径，从而起到保护心肌损伤的作用。

[1]Bell DS. Diabetic cardiomyopathy[J].DiabetesCare, 2003, 26(10): 2949-2951.

[2]Thandavarayan RA, Giridharan W, Watanabe K,etal. Diabetic cardiomyopathy and oxidative stress: role of antioxidants[J].CardiovascHematolAgentsMedChem, 2011, 9(4): 225-230.

[3]Kumar S, Prasad S, Sitasawad SL. Multiple antioxidants improve cardiac complications and inhibit cardiac cell death in streptozotocin-induced diabetic rats[J].PLoSOne, 2013, 8(7): e67009.

[4]曹延萍， 郝咏梅， 刘青娟， 等. 内质网应激及其特有凋亡途径Caspase 12与糖尿病大鼠肾组织固有细胞凋亡之间的关系[J]. 中国应用生理学杂志， 2011, 27(2): 236-240.

[5]Li Z, Zhang T, Dai H,etal. Endoplasmic reticulum stress is involved in myocardial apoptosis of streptozocin-induced diabetic rats[J].JEndocrinol, 2008, 196(3): 565-572.

[6]Patel VB, McLean BA, Chen X,etal. Hydrogen sulfide: an old gas with new cardioprotective effects[J].ClinSci(Lond), 2015, 128(5): 321-323.

[7]Su YW, Liang C, Jin HF,etal. Hydrogen sulfide regulates cardiac function and structure in adriamycin-induced cardiomyopathy[J].CircJ, 2009, 73(4): 741-749.

[8]贾强， 杨锐， 马善峰， 等. 硫化氢对糖尿病大鼠心肌损伤保护作用及其抗凋亡机制[J]. 安徽医科大学学报, 2014, 49(2): 172-176.

[9]康品方， 高琴， 王晓梅， 等. 线粒体融合素2在糖尿病大鼠心肌损伤中的变化[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2012, 17(4):398-402.

[10]Gao Y, Yao X, Zhang Y,etal. The protective role of hydrogen sulfide in myocardial ischemia reperfusion-induced injury in diabetic rats[J].IntJCardiol, 2011, 152(2): 177-183.

[11]张利华， 张薇， 韦广洪， 等. α-亚麻酸对糖尿病大鼠炎症介质和氧化应激的影响[J]. 中国应用生理学杂志, 2012, 28(1): 64-67.

[12]Muriach M, Flores-Bellver M, Romero FJ,etal. Diabetes and the brain: Oxidative stress, inflammation, and autophagy[J].OxidMedCellLongev, 2014, 2014: 102158.

[13]任春久， 张瑶， 崔为正， 等. 氧化应激在2型糖尿病发病机制中的作用研究进展[J]. 生理学报, 2013, 65(6): 664-673.

[14]Barr LA, Shimizu Y, Lambert JP,etal. Hydrogen sulfide attenuates high fat diet-induced cardiac dysfunction via the suppression of endoplasmic reticulum stress[J].NitricOxide, 2015, 46: 145-156.

[15]Zhao Y, Yan Y, Zhao Z,etal. The dynamic changes of endoplasmic reticulum stress pathway markers GRP78 and CHOP in the hippocampus of diabetic mice[J].BrainResBull, 2015, 111: 27-35.

Effect of hydrogen sulfide on oxidative stress and endoplasmic reticulum stress in diabetic cardiomyopathy

YANG Rui, JIA Qiang, LIU Xiao-fen, GAO Qin, WANG Lei, MA Shan-feng△

(Department of Physiology, Bengbu Medical College, Bengbu 233030, China)

Objective: To investigate the effects of hydrogen sulfide (H2S) on oxidative stress and endoplasmic reticulum stress (ERS) in a rat model of diabetic cardiomyopathy (DCM). Methods: Thirty male SD rats were randomly divided into control group, diabetes group and treatment group(n=10). Intraperitoneal injection of streptozotocin was utilized to establish a rat model of DCM．The rats with DCM in treatment group were intraperitoneally injected with NaHS solution. After treated for 12 weeks, the hearts isolated from rats were perfused on a langendorff apparatus. The ventricular hemodynamic parameters were measured. The ultrastructures of myocardium were observed using electron microscopy. The content of malondialdehyde (MDA), the activities of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) in myocardial tissue were determined by spectrophotometry. The expressions of C/EBP homologous protein(CHOP), glucose-regulated protein 78 (GRP78) and Caspase 12 at mRNA level in myocardium were detected using RT-PCR. Results: Compared with control group, the cardiac function and myocardial ultrastructure were damaged obviously in diabetic rats. In myocardial tissue, the content of MDA was increased, while the activities of SOD and GSH-Px were decreased. CHOP, GRP78 and Caspase 12 mRNA expressions were increased significantly. Compared with diabetes group, cardiac function and myocardial ultrastructure damage were improved in treatment group. The content of MDA was decreased, while the activities of SOD and GSH-Px were increased significantly. The mRNA levels of CHOP, GRP78 and Caspase 12 were increased. Conclusion: H2S can protect myocardium in diabetic rats, maybe it is related to reduce oxidative stress damage and inhibition of the ERS-induced apoptosis pathway.

hydrogen sulfide；diabetic cardiomyopathy；rat；oxidative stress；endoplasmic reticulum stress

国家自然科学基金(81000074)；安徽省教育厅自然科学研究项目(KJ2013B146，KJ2015B006by,KJ2015A163)；蚌埠医学院科研项目(BY0907、BYKY1312)

2015-01-30

2015-06-15

△Tel：0552-3175269； E-mail：msfbio@163.com

R363.2

A

1000-6834(2016)01-008-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.003