抑制miR-101表达对结直肠癌SW480细胞增殖、周期及凋亡的影响

刘燕，陆滟霞，周敏，郑林，李学农

(1 川北医学院病理学系，四川南充637000；2 川北医学院附属医院;3 南方医科大学病理学系)



抑制miR-101表达对结直肠癌SW480细胞增殖、周期及凋亡的影响

刘燕1,2，陆滟霞3，周敏3，郑林3，李学农3

(1 川北医学院病理学系，四川南充637000；2 川北医学院附属医院;3 南方医科大学病理学系)

目的观察抑制miR-101表达对结直肠癌细胞SW480增殖、细胞周期及凋亡的影响。方法取SW480细胞分为A、B、C组，A组转染miR-101抑制物，抑制miR-101表达，B组转染无义序列miRNA，C组为不做任何处理的空白组。转染48 h时观察各组细胞增殖、周期及凋亡情况。结果随时间增加，各组细胞细胞增殖的OD值均升高(P均<0.05)；培养第2、3、4、5天A组细胞增殖的OD值均高于B、C组(P均<0.05)。转染48 h时A组S期细胞所占比例明显高于B、C组，G1与G2/M期细胞所占比例明显低于B、C组(P均<0.05)。A、B、C组细胞凋亡率分别为3.29%±0.09%、4.57%±0.21%、2.00%±0.11%( F=230.762;P<0.05)。结论抑制miR-101表达可促进SW480细胞增殖、阻滞细胞周期于S期、抑制细胞凋亡。干扰miR-101后能够促进结直肠癌细胞SW480的增殖，细胞S期周期阻滞及抑制细胞凋亡。

微小RNA;miR-101；结肠肿瘤；直肠肿瘤；细胞增殖；细胞凋亡；细胞周期

miR-101是微小RNA(miRNA)家族中的一员，在肿瘤的发生、转移及侵袭等过程中发挥重要作用[1,2]。miR-101抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭[3,4]。目前关于miR-101对结直肠癌细胞的增殖、凋亡影响的相关研究较少。本课题组前期研究发现，miR-101在低转移的结直肠癌细胞株SW480中表达水平较高，而在高转移细胞株SW620中表达水平较低，并能靶向调控RACl的表达[5]。2013年8月～2014年6月，我们观察了miR-101SW480细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响，现将结果报告如下。

1　材料与方法

1.1细胞、材料、试剂及仪器结直肠癌细胞株SW480由本实验室保存，置于含5%胎牛血清的RPMI1640完全培养基，37 ℃、5%CO2细胞培养箱内培养。胰酶购自于杭州吉诺公司，细胞周期试剂盒、细胞凋亡试剂盒均购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2SW480细胞分组及miR-101抑制物转染方法取适量对数生长期SW480细胞，分为A、B、C组，A组转染miR-101抑制物，抑制miR-101表达，B组转染无义序列miRNA，所有操作均严格按照使用说明书进行；C组为不做任何处理的空白组。转染36 h时采用荧光定量PCR检测各组miR-101，A组miR-101的相对表达量(0.546 1±0.028 7)低于B、C组(分别为0.816 7±0.0597 4、1.000±0)，差异具有统计学意义，说明转染成功。

1.3各组细胞增殖情况观察采用CCK-8法。取转染48 h时各组细胞，消化后计数，接种于96孔板中，2 000/孔，每组3个复孔。待细胞贴壁后，每孔加入10 μL CCK-8试剂后37 ℃孵育2 h，以blank对照孔进行调零，分别于第2、3、4、5天使用Glo MaxTM96 Microplate Luminometer发光检测仪检测各组OD值，以OD值表示该组细胞增殖能力的大小，OD值越大代表细胞增殖能力越强。实验重复3次，取平均值。

1.4各组细胞周期观察干预48 h时取对数生长期各组细胞，PBS清洗2次，加入胰酶消化，2 000 r/min离心5mim，第2 d于室温下1 000 r/min离心5min，PBS清洗2次，然后加入100 μL RNase A，37 ℃水浴30 min后，加入400 μL PI，混匀后4 ℃避光30 min。采用流式细胞仪观察各组细胞周期，计算细胞周期G1、S、G2/M期所占比例。实验重复3次，取平均值。

1.5各组细胞凋亡情况观察干预48 h时取对数生长期各组细胞，PBS冲洗2次，2 000 r/min离心5min，收集(1～5)×105细胞，加入500 μL 1×Binding Buffer 悬浮细胞，加入1 μL AnneXinV-PE，轻轻混匀，4 ℃避光反应15 min，加入5 μL7AAD再次混匀，4℃避光孵育15min，采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。

2　结果

2.1各组细胞增殖情况比较不同培养时间A、B、C组细胞增殖的OD值比较见表1。随时间增加，各组细胞细胞增殖的OD值均升高(P均<0.05)。分别培养第2、3、4、5天，A组细胞增殖OD值高于B、C组(P均<0.05)。

表1　不同培养时间各组细胞增殖的OD值±s)

2.2各组细胞周期比较分析转染48 h时各组细胞周期比较见表2。转染48 h时A组S期细胞所占比例明显高于B、C组，G1与G2/M期细胞所占比例明显低于B、C组(P均<0.05)。

表2　干预48 h时各组细胞周期分布

2.3各组细胞凋亡率比较A、B、C组细胞凋亡率分别为3.29%±0.09%、4.57%±0.21%、2.00%±0.11%，组间两两比较，P均<0.05。

3　讨论

miRNAs是一类类似于癌或抑癌基因作用的非编码小分子RNA家族[4]。研究发现，miR-101在乳腺癌[1]、肺癌、肝癌、前列腺癌、垂体腺瘤、胰腺癌、骨肉瘤[2，4]、胆囊癌[3]等实体肿瘤中表达下调，可能参与肿瘤的发生、转移、侵袭等过程，起着抑制肿瘤发生的作用[3]。在肺癌细胞中，miR-101通过靶向调控COX-2的表达可抑制肺癌细胞的增殖与迁移[6,7]。Lv等[8,9]研究表明，在胃癌细胞及其组织中miR-101的表达均下调，并且与肿瘤的生长、侵袭和转移密切相关。在结直肠癌中，miR-101可在转录后水平调控EP4受体的表达[10]。在结直肠癌中miR-101可调控EP4受体、PTGS2及ASPN的表达[11]。miR-101可靶向调控下调EZH2抑制食管癌细胞的增殖、迁移能力[12]；CXCR7而抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭能力[13]；靶向作用于Rac1抑制甲状腺乳头状癌细胞的生长[14]，本课题组前期研究中也发现而miR-101能靶向调控结直肠癌细胞RACl表达[9]。表明miR-101可能通过靶向调控RAC1调节结直肠癌的生物学行为，参与结直肠癌的发生进展过程。

本研究发现，A组细胞增殖的OD值均高于B、C组，这表明miR-101可能抑制结直肠癌细胞的增殖。Strillaccia 等[11]研究发现，在结肠癌患者的癌组织标本中miR-101表达明显低于其癌旁组织，高表达 miR-101可抑制结肠癌细胞的远处转移。与本研究结果一致。

对于已经发生转移的结直肠癌，放射治疗是重要的治疗方式方式，其效果如何，与肿瘤细胞周期分布密不可分。通常认为G2/M期对放疗最为敏感，G1次之，S期最不敏感。细胞发生G2/M 期阻滞时将无法完成其DNA 损伤修复,从而引起G2/M 期阻滞延长,细胞的增殖能力下降,导致细胞增殖死亡[15,16]。miR-101是否能增强结直肠癌患者对放疗的敏感性，尚有待于进一步研究[17]。本研究发现，B组细胞凋亡率明显高于A、C组，A组细胞凋亡率明显高于C组，差异均具有统计学意义，表明miR-101可能促进结直肠癌细胞的凋亡，且转染过程本身可能导致细胞着损伤，促进细胞凋亡。

综上所述，抑制miR-101表达可促进SW480细胞增殖、阻滞细胞周期于S期、抑制细胞凋亡。干扰miR-101后能够促进结直肠癌细胞SW480的增殖，细胞S期周期阻滞及抑制细胞凋亡。但其具体机制尚有待于今后进一步研究。

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国家自然科学基金资助项目(81272758，81302158)。

李学农(E-mail: leexue0@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.012

R782

A

1002-266X(2016)27-0038-03

2016-02-17)