子宫内膜异位症患者异位内膜组织中Twist蛋白、E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白表达变化

朱翔翡，陆晓媛，王静

(1徐州医学院研究生学院，江苏徐州221002；2徐州医学院附属医院)



子宫内膜异位症患者异位内膜组织中Twist蛋白、E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白表达变化

朱翔翡1，陆晓媛2，王静2

(1徐州医学院研究生学院，江苏徐州221002；2徐州医学院附属医院)

目的观察子宫内膜异位症患者异位子宫内膜组织中Twist蛋白、E-钙黏蛋白(E-cadherin)及N-钙黏蛋白(N-cadherin)的表达变化，探讨三者与子宫内膜异位症的关系。方法采用免疫组化SP法检测30例子宫内膜异位症患者在位内膜组织(在位内膜组)、异位内膜组织(异位内膜组)及30例非子宫内膜异位症患者的正常内膜组织(正常对照组)中的Twist蛋白、E-cadherin、N-cadherin，计算各组蛋白高表达(强阳性表达)率；分析异位内膜组织中Twist蛋白、E-cadherin、N-cadherin表达的相关性。结果异位内膜组、在位内膜组、正常对照组中Twist蛋白高表达率分别为70.0%、30.0%、6.7%，E-cadherin高表达率分别为6.7%、23.3%、73.3%，N-cadherin高表达率分别为66.7%、30.0%、3.3%，Twist蛋白及N-cadherin高表达率在异位内膜组、在位内膜组、正常对照组依次升高，E-cadherin高表达率依次减小(P均<0.05)。异位内膜组织中Twist蛋白表达与E-cadherin表达呈负相关关系(r=-0.463，P<0.01)，与N-cadherin表达呈正相关关系(r=0.616，P<0.01)；E-cadherin表达与N-cadherin表达呈负相关关系(r=-0.502，P<0.01)。结论子宫内膜异位症患者的异位子宫内膜组织中Twist蛋白和N-cadherin表达上调，E-cadherin表达下调，三者相互作用，共同参与了子宫内膜异位症的发生发展。

子宫内膜异位症；异位子宫内膜;Twist蛋白；E-钙黏蛋白；N-钙黏蛋白；上皮间质转化

子宫内膜异位症(EMs)是妇科常见病、多发病，也是具有转移及复发特点的良性疾病，其发病原因目前尚不明确。近年来研究者[1]提出“在位内膜决定论”，即异位子宫内膜的种植、生长与子宫内膜的增殖、侵袭、转移等能力密不可分。子宫内膜的转移能力可能与上皮间质转化(EMT)有关[2，3]。上皮间质转化因子Twist基因、E-钙黏蛋白(E-cadherin)及N-钙黏蛋白(N-cadherin)是EMT过程中的重要因子[4，5]，在乳腺癌、膀胱癌等恶性疾病中研究较多，但对于三者在子宫内膜异位症中的表达少有报道。为此，本研究观察了子宫内膜异位症患者异位子宫内膜组织中Twist蛋白、E-cadherin及N-cadherin的表达变化，分析三者与子宫内膜异位症发生发展的关系。现报告如下。

1　资料与方法

1.1临床资料选取2013年9月～2015年7月在徐州医学院附属医院行腹腔镜下盆腔子宫内膜异位病灶清除术的子宫内膜异位症患者30例，年龄24～52岁，术中留取异位内膜组织(异位内膜组)和在位内膜组织(在位内膜组)各30例份。随机选取行诊断性刮宫治疗的非子宫内膜异位症患者30例，年龄28～51岁，术中留取正常增生期子宫内膜组织30例份(正常对照组)。纳入研究的所有患者均未合并其他子宫内膜病变，术前6个月内未行性激素类药物或其他药物治疗，未放置宫内节育器，无妊娠及哺乳、刮宫史，无内分泌疾病及免疫疾病。子宫内膜异位症患者与非子宫内膜异位症患者的年龄、孕次和月经周期资料具有可比性。见表1。

表1　纳入患者年龄、孕次、月经周期比较±s)

1.2主要试剂及仪器兔抗人多克隆抗体Twist购自北京博奥森生物技术有限公司，兔抗人多克隆抗体E-cadherin购自美国Proteintech Group公司(由徐州博立达生物科技有限公司代购)，兔抗人多克隆抗体N-cadherin购自美国Proteintech Group公司(由徐州博立达生物科技有限公司代购)，SP免疫组化试剂盒及DAB显色剂均购自徐州博立达生物科技有限公司。

1.3Twist蛋白、E-cadherin、N-cadherin检测采用免疫组化SP法。具体步骤如下：石蜡常规包埋组织，4 μm连续切片；切片脱蜡，水化；高压修复5 min(出蒸汽后计算)，使用枸橼酸修复液；3%过氧化氢封闭30 min；PBS清洗后滴加一抗，4 ℃过夜；滴加生物素标记的二抗，室温30 min；滴加SP，室温30 min；DAB显色；苏木精复染。首先在低倍镜下阅片，再在高倍镜下选取5个视野进行计数，计数不少于100个细胞，以细胞中出现棕褐色、棕黄色或淡黄色颗粒为蛋白表达阳性[6，7]；Twist、N-cadherin主要定位于细胞质，细胞膜也有少量表达；E-cadherin主要定位于细胞膜，少数在细胞质有表达。根据染色强度与阳性细胞百分比判定结果：染色强度为无色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；阳性细胞百分比≤5%计0分，>5%～25%计1分，>25%～50%计2分，>50%计3分；两项积分相加，0、1分为阴性(-)，2分为弱阳性(+)，3、4分为阳性(++)，5、6分为强阳性(+++)，统计强阳性表达(高表达)例数。

1.4统计学方法采用SPSS16.0软件进行统计分析。计数资料采用χ2检验；相关性分析采用Pearson相关分析法。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组子宫内膜组织中Twist蛋白、E-cadherin、N-cadherin表达比较异位内膜组、在位内膜组、正常对照组中Twist蛋白高表达率分别为70.0%、30.0%、6.7%，E-cadherin高表达率分别为6.7%、23.3%、73.3%，N-cadherin高表达率分别为66.7%、30.0%、3.3%，Twist蛋白及N-cadherin高表达率在异位内膜组、在位内膜组、正常对照组依次升高，E-cadherin高表达率依次减小(P均<0.05)。详见表2。

表2　不同子宫内膜组织中Twist蛋白、E-cadherin、N-cadherin表达比较

注：与正常对照组相比，*P<0.05；与在位内膜组相比，#P<0.05。

2.2异位内膜组织中Twist蛋白、E-cadherin、N-cadherin表达相关性分析异位内膜组织中Twist蛋白表达与E-cadherin表达呈负相关关系(r=-0.463，P<0.01)，与N-cadherin表达呈正相关关系(r=0.616，P<0.01)；E-cadherin表达与N-cadherin表达呈负相关关系(r=-0.502，P<0.01)。

3　讨论

EMT存在于在胚胎发育、组织重建、慢性炎症等过程中，EMT伴随上皮细胞极性消失、细胞骨架重塑、细胞间黏附力减弱及细胞迁移能力增强[8，9]。近年研究发现，EMT与肿瘤转移及多种纤维化疾病的发病有关。钙黏蛋白在EMT过程中发挥重要作用。上皮细胞间连接需要E-cadherin，其高表达可抑制细胞迁移，使细胞保持完整、紧密连接，并完成机体相关指令；而在多种因素影响下，如肿瘤基因突变、基因异常转录后修饰(磷酸化或糖基化)、蛋白水解增强等均可导致E-cadherin表达下调或缺失，减弱细胞黏附能力，细胞极性发生改变、运动能力增强，容易发生侵袭和转移[10]。多数肿瘤组织中E-cadherin表达受抑，导致细胞表型改变，间充质细胞中N-cadherin表达增高，肿瘤细胞侵袭转移能力增强[11，12]，因此，E-cadherin表达降低提示EMT的发生[13]。本研究中，异位内膜组E-cadherin高表达率低于在位内膜组和正常对照组，而N-cadherin表达趋势与之相反，印证了子宫内膜异位症的转移及侵袭性与EMT有关。

Twist基因是参与EMT过程的一种凋亡抑制因子，多项研究显示其能够独立抑制E-cadherin表达同时上调纤连蛋白和N-cadherin表达。人Twist蛋白通过分子中的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)可特异性结合DNA上的E-box序列(CANNTG)[14]形成同源或异源二聚体，调节靶基因转录。国内外研究[15，16]表明，Twist作为上皮间质转录因子，与恶性肿瘤细胞的原位侵袭和远处转移均有密切关系。

本研究中，E-cadherin在正常对照组、在位内膜组、异位内膜组表达依次降低，N-cadherin表达依次增高，且E-cadherin与N-cadherin表达呈负相关关系、提示E-cadherin表达降低、N-cadherin表达上调是EMT发生的标志，子宫内膜异位症发生发展过程中伴随着EMT。而Twist蛋白在异位内膜组织中高表达，且Twist蛋白与E-cadherin表达呈负相关关系、与N-cadherin表达呈正相关关系，同样说明Twist蛋白表达上调与EMT关系密切。推测Twist蛋白过度表达抑制了E-cadherin的正常表达，细胞极性减弱，N-cadherin表达上调，最终导致细胞迁移能力增强。Twist蛋白可能通过诱发EMT从而促进子宫内膜异位症的发生发展。

综上所述，Twist蛋白高表达、E-cadherin低表达、N-cadherin高表达使得患者子宫内膜细胞容易从原位脱离，侵袭力增强。Twist蛋白、E-cadherin、N-cadherin在异位子宫内膜组织中的表达变化印证了EMT贯穿子宫内膜异位症的各个环节。基于上述实验结果，我们设想Twist、E-cadherin、N-cadherin有望成为子宫内膜异位症早期诊断的标志物及基因治疗的靶点，联合检测三种蛋白有望为子宫内膜异位症的预防、治疗、预后评估提供参考。

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陆晓媛(E-mail: 378158854@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.19.022

R711.71

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1002-266X(2016)19-0062-03

2015-12-08)