四种宫颈脱落细胞HPV DNA检测方法在高度宫颈病变筛查中的应用对比观察

刘燕青，吴晓梅，余韬，黎鳞华

(1云南省第一人民医院，昆明650000；2昆明医学院第一附属医院)



四种宫颈脱落细胞HPV DNA检测方法在高度宫颈病变筛查中的应用对比观察

刘燕青1，吴晓梅1，余韬1，黎鳞华2

(1云南省第一人民医院，昆明650000；2昆明医学院第一附属医院)

目的评价并比较PCR反向杂交技术、Ⅱ代杂交捕获技术(HC-Ⅱ)、实时荧光定量PCR(real-time PCR)8型(real-time PCR-8)和real-time PCR 13型(real-time PCR-13)技术检测宫颈脱落细胞人乳头瘤病毒(HPV) DNA对高度宫颈病变[宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅱ及以上]的筛查效能。方法宫颈薄层液基细胞学检测(TCT)报告异常的患者436例，采集患者宫颈脱落细胞，分别采用PCR反向杂交技术、HC-Ⅱ、real-time PCR-8、real-time PCR-13技术检测HPV DNA，以病理诊断为金标准，比较四种方法的筛查效能。结果PCR反向杂交法、HC-Ⅱ、real-time PCR-8、real-time PCR-13检查对HPV DNA阳性检出率分别为70.0%、73.2%、70.9%、75.5%，四种方法HPV DNA检出率相比，P均>0.05。4种HPV DNA检测方法在宫颈慢性炎症、CINⅠ、CIN Ⅱ、CIN Ⅲ、宫颈鳞状细胞癌(CSCC)患者中的HPV DNA阳性检出率差异无统计学意义(P均>0.05)。四种HPV DNA检测方法对高度宫颈病变筛查的敏感度、特异度、阳性预测值和约登指数差异无统计学意义(P均>0.05)。所有标本共发现18种HPV基因型，其中302例检出高危型HPV。检出高危型HPV多重感染100例，其中四重感染2例、三重感染6例、二重感染92例；高低危型HPV多重感染52例。结论采用real-time PCR-8、real-time PCR-13、PCR反向杂交法及HC-Ⅱ法检测宫颈脱落细胞HPV DNA对高度宫颈病变的筛查效能相近。

宫颈上皮内瘤变；宫颈癌前病变；宫颈癌；人乳头瘤病毒；Ⅱ代杂交捕获技术；聚合酶链反应

宫颈癌临床发病率、病死率均较高，早期诊断及干预尤为重要。人乳头瘤病毒(HPV)感染与宫颈癌、宫颈上皮内瘤变(CIN)的发生及进展密切相关[1]。高危型HPV检测是目前临床初步筛查宫颈癌的重要方式。Ⅱ代杂交捕获技术(HC-Ⅱ)应用于宫颈癌筛查中有较高的特异度及灵敏度，其他HPV DNA检测方法常以HC-Ⅱ检测结果作为标准对照[2～4]，但HC-Ⅱ无法对HPV分型，而HPV分型对于宫颈病变程度评估及HPV流行情况分析等意义重大。目前HPV分型检测均以PCR为基础，敏感性较高，临床上应用日益广泛。由于PCR操作过程中易因污染导致假阳性，难以在不同实验室建立统一的标准，许多基于PCR的检测方法的实用性、准确性尚不明确。基于PCR的HPV DNA检测相关研究报道较多[5～7]，但较少对不同PCR方法的筛查价值进行比较。为此，本研究评价并比较了PCR反向杂交技术、HC-Ⅱ、实时荧光定量PCR(real-time PCR)8型(real-time PCR-8)和real-time PCR 13型(real-time PCR-13)技术检测宫颈脱落细胞HPV DNA对高度宫颈病变(CINⅡ及以上)的筛查效能，现报告如下。

1　资料与方法

1.1临床资料2013年12月～2015年4月进行宫颈癌前病变筛查且宫颈薄层液基细胞学检测(TCT)报告异常的患者436例，年龄21～66(38±12)岁。

1.2宫颈脱落细胞中HPV DNA检测每例患者收集宫颈脱落细胞(移形带处)标本2份，采样在非月经期进行，采样前1 d无性生活，3 d内未使用阴道栓剂。将宫颈脱落细胞保存于细胞存储液中，3 d内分别采用PCR反向杂交技术、HC-Ⅱ、real-time PCR-8、real-time PCR-13检测HPV DNA。收集四种方法对HPV DNA的检测结果，以病理检查结果为金标准[包括宫颈慢性炎症、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈鳞状细胞癌(CSCC)]，计算并比较4种检测方法筛查高度宫颈病变的灵敏度、特异度、阳性及阴性预测值、约登指数。

1.3统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行分析。计数资料采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

PCR反向杂交法、HC-Ⅱ、real-time PCR-8、real-time PCR-13检查对高危HPV DNA阳性检出率分别为70.0%、73.2%、70.9%、75.5%，四种方法HPV DNA检出率相比，P均>0.05。436例患者中，病理诊断为宫颈慢性炎症174例、CSCC 14例、CINⅠ122例、CINⅡ68例、CINⅢ58例。4种HPV DNA检测方法对宫颈慢性炎症、CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ、CSCC患者宫颈脱落细胞HPV DNA的阳性检出率差异无统计学意义(P均>0.05)。详见表1。四种HPV DNA检测方法对高度宫颈病变筛查的敏感度、特异度、阳性预测值和约登指数差异无统计学意义(P均>0.05)。详见表2。

表1　四种HPV DNA检测方法对不同宫颈病变患者宫颈脱落细胞HPV DNA的阳性检出率比较(%)

表2　四种HPV DNA检测方法对高度宫颈病变筛查的敏感度、特异度、阳性预测值和约登指数比较(%)

本次检测中共发现18种HPV基因型，其中302例检出高危型HPV，其中HPV68 5例、HPV59 6例、HPV582 2例、HPV56 10例、HPV521 20例、HPV5 15例、HPV4 52例、HPV39 18例、HPV35 5例、HPV33 35例、HPV31 14例、HPV18 18例、HPV16 42例，共13种。检出高危型HPV多重感染100例，其中四重感染2例、三重感染6例、二重感染92例；高低危型HPV多重感染52例。

3　讨论

多项研究[8～10]表明，高危型HPV长期感染为宫颈癌发生和进展的必要条件，高危HPV筛查对早期发现宫颈癌变意义重大。PCR和HC-Ⅱ技术是目前应用最广的HPV DNA检测技术[11]。HC-Ⅱ是惟一得到FDA认证的HPV DNA检测技术。HC-Ⅱ法可检测包括5种低危型HPV和13种高危型HPV，检测过程高度标准和自动化，具有良好的可重复性，实验结果不受地理和人为条件限制，具有定量设计及高效等优点[12]。基于PCR的多种HPV DNA检测技术可同时开展多种病毒亚型的高通量测定，为当前HPV DNA检测和分型敏感度最佳的技术[13]。但由于各个实验室开发的基于PCR的检测方法尚未形成统一标准，且PCR操作过程中易受污染而出现假阳性，故其在宫颈病变筛查中的应用价值仍待深入研究[14]。

我们同时采用HC-Ⅱ、real-time PCR-8、real-time PCR-13、PCR反向杂交法对宫颈TCT报告异常的受检者行宫颈脱落细胞HPV DNA检测，综合评价了4种方法对高度宫颈病变的筛查效能。本研究结果显示，real-time PCR-8、real-time PCR-13、PCR反向杂交法及HC-Ⅱ法HPV DNA阳性检出率差异无统计学意义，表明基于PCR的HPV DNA检测已具有较为稳定的效能。4种方法筛查高度宫颈病变的特异度、灵敏度等指标差异均无统计学意义，提示PCR反向杂交法、real-time PCR-8、real-time PCR-13法检测宫颈脱落细胞HPV DNA对高度宫颈病变的筛查效能与HC-Ⅱ法相近，这与相关研究[15～19]结论一致。另外，本研究中宫颈慢性炎症组real-time PCR-13法的HPV DNA检出率高于HC-Ⅱ法，推测可能为宫颈慢性炎症患者HPV病毒含量较低而real-time PCR对低浓度DNA敏感性较好所致。研究发现，当标本的HPV病毒含量低于1×104copies/mL时，PCR反向杂交法检测结果可为阴性，这导致PCR反向杂交法在宫颈炎症组标本中HPV DNA阳性检出率较低。而随着宫颈病变程度加重，HPV病毒负荷量及多重感染率均随之上升，四种方法的检出率也更加一致。

我们还发现，本地区受检者主要感染的高危型HPV为HPV52、16、33、58、18、39。通过基因分型还发现HC-Ⅱ法测得的高危型HPV与个别中低危型HPV(HPV6、HPV66)存在交叉反应，real-time PCR法检测高危型HPV与个别中低危型HPV(HPV43、HPV53)也存在交叉反应，有助于提高高危型HPV的检出率。HC-Ⅱ法与PCR反向杂交法灵敏度相近，且PCR反向杂交法的约登指数较高，这与徐华林等[20]的观点一致。

综上所述，采用real-time PCR-8、real-time PCR-13、PCR-反向杂交法及HC-Ⅱ法检测宫颈脱落细胞HPV DNA对高度宫颈病变的筛查效能相近。

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余韬(E-mail：zy55421@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.19.019

R711.74

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1002-266X(2016)19-0055-03

2016-01-25)