不同子宫内膜癌细胞系中G蛋白耦联受体30 mRNA及蛋白表达观察

叶佳，杨晓清，盛楠，马勤宜，张玉泉

(1南通大学附属医院，江苏南通226001;2南通市妇幼保健院)



不同子宫内膜癌细胞系中G蛋白耦联受体30 mRNA及蛋白表达观察

叶佳1*，杨晓清1，盛楠1，马勤宜2，张玉泉1

(1南通大学附属医院，江苏南通226001;2南通市妇幼保健院)

目的观察不同子宫内膜癌细胞系中G蛋白耦联受体30(GPR30)mRNA及蛋白的表达变化。方法收集正常增生期人子宫内膜组织，原代培养子宫内膜腺上皮细胞并鉴定。体外培养人子宫内膜癌细胞系ISK(ERα阳性、ERβ阳性、高分化)、RL95-2(ERα阳性、ERβ阳性、中分化)、HEC-1-B(ERα阴性、ERβ阳性、中分化)、KLE(ERα阴性、ERβ阴性、低分化)。采用real-time PCR法检测正常子宫内膜腺上皮细胞及不同子宫内膜癌细胞系中的GPR30 mRNA，采用Western blotting法检测GPR30蛋白。结果子宫内膜腺上皮细胞、ISK细胞系、RL95-2细胞系、HEC-1-B细胞系、KLE细胞系中GPR30 mRNA相对表达量分别为0.016±0.002、0.032±0.004、0.049±0.003、0.051±0.006、0.083±0.001，GPR30蛋白相对表达量分别为0.31±0.22、0.57±0.01、1.21±0.04、1.34±0.05、1.77±0.01。各子宫内膜癌细胞系中GPR30 mRNA及蛋白相对表达量均高于子宫内膜腺上皮细胞(P均<0.05)；ISK细胞系中GPR30 mRNA及蛋白相对表达量最低，与RL95-2细胞系、HEC-1-B细胞系、KLE细胞系相比，P均<0.05；KLE细胞系中GPR30 mRNA及蛋白相对表达量高于HEC-1-B细胞系及RL95-2细胞系(P均<0.05)。结论不同子宫内膜癌细胞系中GPR30 mRNA及蛋白均呈高表达，且在高、中、低分化的子宫内膜癌细胞系中表达水平逐渐增高。

子宫内膜癌；子宫内膜癌细胞系；G蛋白耦联受体30；孕激素受体；子宫内膜腺上皮细胞

近年来研究发现，雌激素作用于靶细胞后可引起快速细胞反应，仅需几秒到几分钟即可发挥生物效应，此过程与传统的雌激素基因组效应不同，并不激活相关基因转录，因此称为雌激素的“非基因组效应”。G蛋白耦联受体30(GPR30)在介导这种效应中起到重要作用[1]，被认为是一种新型雌激素受体。GPR30介导的信号转导途径可能在肿瘤细胞(尤其是ERα、ERβ阴性的Ⅱ型子宫内膜癌细胞)的增殖及迁移中起关键作用[2]。2010年8月～2013年1月，我们观察了不同子宫内膜癌细胞系中GPR30 mRNA及蛋白的表达变化，探讨GPR30在子宫内膜癌发生、发展中的作用。

1　材料与方法

1.1主要实验材料人子宫内膜癌细胞系ISK(ERα阳性、ERβ阳性、高分化)购自湘雅医学院细胞中心(由南通大学附属医院妇产科实验室保存)，人子宫内膜癌细胞系RL95-2(ERα阳性、ERβ阳性、中分化)、HEC-1-B(ERα阴性、ERβ阳性、中分化)购自中科院上海细胞库，人子宫内膜癌细胞系KLE(ERα阴性、ERβ阴性、低分化)购自中国典型培养物保藏中心。RPMI1640、MEM培养基购自美国Gibco公司，DMEM-F12培养基购自美国Sigma公司，TRIzol试剂购自美国Introvigen公司，逆转录试剂盒购于杭州博日科技有限公司，real-time PCR试剂盒购于TaKaRa生物有限公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒增强型、小鼠抗人β-actin单克隆抗体购自碧云天生物技术研究所，兔抗人GPR30多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG购于美国Odyssey公司，FITC标记羊抗兔IgG购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2子宫内膜腺上皮细胞获取及子宫内膜癌细胞系培养

1.2.1子宫内膜腺上皮细胞获取方法正常增生期子宫内膜组织取自2010年8～11月因子宫肌瘤(非黏膜下肌瘤)在南通大学附属医院行全子宫切除术的患者。患者年龄20～45岁，月经周期正常，未放置宫内节育器，近3个月未口服药物避孕，术后病理证实子宫内膜正常。参考文献[3]方法并适当改进，分离培养8例患者的子宫内膜腺上皮细胞，细胞纯度>95%。免疫荧光化学检查结果显示细胞角蛋白染色阳性、波形蛋白染色阴性，证明所得细胞为子宫内膜腺上皮细胞。

1.2.2子宫内膜癌细胞系培养方法ISK细胞培养液为RPMI1640基础培养基添加10%FBS、100 U/mL青霉素及100 U/mL链霉素。RL95-2细胞培养液为DMEM-F12培养基添加10 mmol/L HEPES、2.0 g/L碳酸氢钠、0.005 mg/mL胰岛素、10%FBS、100 U/mL青霉素及100 U/mL链霉素。HEC-1-B细胞培养液为E-MEM培养基添加1.0 mmol/L丙酮酸钠、0.1 mmol/L非必需氨基酸、1.5 g/L碳酸氢钠、10% FBS、100 U/mL青霉素及100 U/mL链霉素。KLE细胞培养液为DMEM-F12培养基添加15 mmol/L HEPES、0.5 mmol/L丙酮酸钠、1.2 g/L碳酸氢钠、2.5 mmol/L L-谷氨酰胺、10%FBS、100 U/mL青霉素及100 U/mL链霉素。细胞均在37 ℃、含5% CO2的无菌培养箱中培养。四种细胞均贴壁生长，每2～3 d用0.25%胰酶消化传代。

1.3不同细胞中GPR30 mRNA及蛋白检测

1.3.1GPR30 mRNA检测取对数生长期细胞，TRIzol法提取子宫内膜腺上皮细胞和子宫内膜癌细胞的总RNA。紫外分光光度计测总RNA OD260/OD280在1.8～2.0。从NCBI获得GPR30 mRNA及内参β-actin mRNA全序列，利用Primer Remier5.0引物设计软件设计引物，由上海生工生物工程有限公司合成引物。目的基因引物序列及产物长度见表1。将RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，按照试剂盒说明书配制PCR反应液。取cDNA 2 μL，使总反应体系为25 μL，采用两步法PCR反应检测GPR30 mRNA。PCR反应条件：95 ℃ 30 s，1个循环；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40个循环。由Opticon Monitor2软件分析PCR扩增产物原始Ct值，以2-ΔΔCt表示GPR30 mRNA相对表达量。实验重复3次，取均值。

表1　目的基因引物序列及产物长度

1.3.2GPR30蛋白检测采用Western blotting法。收集各组对数生长期细胞，提取蛋白，BCA法测蛋白浓度；蛋白上样15 μg，经10% SDS-PAGE恒压电泳，恒流电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉常温封闭2 h，TBST漂洗；分别加入小鼠抗人β-actin单克隆抗体(1∶1 000稀释)和兔抗人GPR30多克隆抗体(1∶200稀释)，4 ℃孵育过夜；次日加入HRP标记的羊抗兔、羊抗小鼠IgG(1∶2 000稀释)，室温孵育2 h；Odyssey双色红外激光成像系统扫膜成像，Quantity One软件分析蛋白条带灰度值。以GPR30条带与β-actin条带灰度值之比作为GPR30蛋白相对表达量。实验重复3次，取均值。

2　结果

各子宫内膜癌细胞系中GPR30 mRNA及蛋白相对表达量均高于子宫内膜腺上皮细胞(P均<0.05)；ISK细胞系中GPR30 mRNA及蛋白相对表达量最低，与RL95-2细胞系、HEC-1-B细胞系、KLE细胞系相比，P均<0.05；KLE细胞系中GPR30 mRNA及蛋白相对表达量高于HEC-1-B细胞系及RL95-2细胞系(P均<0.05)。详见表2。

表2　子宫内膜腺上皮细胞与各子宫内膜癌细胞系中GPR30 mRNA及蛋白表达比较

注：与子宫内膜腺上皮细胞相比，*P<0.05；与ISK细胞系相比，#P<0.05；与RL95-2细胞系、HEC-1-B细胞系相比，▲P<0.05。

3　讨论

GPR30为7次跨膜G蛋白耦联受体超家族(GPCRs)成员之一，基因位于染色体7p22，全长为2 064 bp，含一长为1 128 bp的开放阅读框架(ORF)，编码一个含375个氨基酸的蛋白质。该蛋白含有1个7次跨膜的高度保守域、3个位于细胞外区域的糖基化位点[4]。GPR30分布于大脑、心脏、血管内皮、淋巴组织、子宫内膜、卵巢、胎盘等正常组织中[5]，在乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌等多种恶性肿瘤中亦有广泛表达[6～9]，其表达水平因肿瘤组织类型、病理状态不同而各有差异，可能参与了激素相关性肿瘤的发生发展[10]。随着GPR30特异性配体G-1[11]与特异性拮抗剂G-15[12]的发现，GPR30的生物学功能得到进一步揭示。

Kolkova等[13]研究发现GPR30主要定位表达于增生中晚期的子宫内膜腺上皮组织中，且在腺上皮细胞中的表达水平高于基质细胞。因此我们选择正常增生期的子宫内膜组织，且在原代培养过程中弃去基质细胞，仅选择分离、纯化出的腺上皮细胞作为实验对象。Ge等[14]研究显示，子宫内膜癌组织中GPR30的表达水平与EGF呈正相关关系，与PR的表达呈负相关关系，与ER表达无相关性。过表达GPR30蛋白的肿瘤组织分化程度较低，常伴深肌层浸润，患者预后较差。GPR30或可成为子宫内膜癌患者不良结局的预测指标。Vivacqua等[15]研究表明，雌激素与GPR30结合后，能激活GPR30下游的ERK/MAPK信号通路，使c-fos原癌基因表达上调，从而诱导子宫内膜癌细胞增殖，此过程与子宫内膜癌细胞内ERα存在与否无关，提示GPR30可能在ER阴性的Ⅱ型子宫内膜癌的发生发展中起关键作用。

我们前期研究已发现GPR30在子宫内膜癌细胞系ISK细胞质中的表达高于细胞膜，其亚细胞定位主要在粗面内质网[16]。为了进一步扩大研究，我们体外培养了不同特点的人子宫内膜癌细胞系，观察各细胞系中GPR30 mRNA及蛋白的表达变化。四种癌细胞系分别为高、中、低分化级别，其中ISK、RL95-2中ERα、ERβ阳性，HEC-1-B、KLE中ERα、ERβ阴性，RL95-2、HEC-1-B同为中分化级别，但ERα、ERβ的表达有差异。本研究结果显示，GPR30 mRNA及蛋白在四种子宫内膜癌细胞系中的表达均高于正常子宫内膜腺上皮细胞，在低分化的KLE细胞系中表达量最高，在高分化的ISK细胞系中表达量最低。上述结果提示不同子宫内膜癌细胞系中GPR30 mRNA及蛋白均呈高表达，且在高、中、低分化的子宫内膜癌细胞系中表达水平逐渐增高；GPR30表达与子宫内膜癌细胞分化程度有关，其可能参与了子宫内膜癌的发生、发展。GPR30有望成为子宫内膜癌的一个新的治疗靶点。在后续研究中，我们将继续探索GPR30的相关作用机制。

[1] Ariazi EA,Brailoiu E,Yerrum S,et al.The G protein-coupled receptor GPR30 inhibits proliferation of estrogen receptor-positive breast cancer cells [J].Cancer Res,2010,70(3):1184-1194.

[2] Lappano R,Rosano C,Santolla MF,et al.Two novel GPER agonists induce gene expression changes and growth effects in cancer cells[J].Curr Cancer Drug Targets,2012,12(5):531-542.

[3] 杨晓清,张沐,唐小军,等.人子宫内膜细胞的纯化、培养方法的改进及细胞保存[J].江苏医药,2012,38(4):389-392.

[4] Wang D,Hu L,Zhang G,et al.G protein-coupled receptor 30 in tumor development[J].Endocrine,2010,38(1):29-37.

[5] Cygankiewicz AI,Jacenik D,Krajewska WM,et al.GPER receptor - the new player in estrogen signaling[J].Postepy Biochem,2015,61(1):52-60.

[6] Marjon NA,Hu C,Hathaway HJ,et al.G protein-coupled estrogen receptor regulates mammary tumorigenesis and metastasis[J].Mol Cancer Res,2014,12(11):1644-1654.

[7] Du GQ,Zhou L,Chen XY,et al.The G protein-coupled receptor GPR30 mediates the proliferative and invasive effects induced by hydroxytamoxifen in endometrial cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,420(2):343-349.

[8] Heublein S,Mayr D,Friese K,et al.The G-protein-coupled estrogen receptor (GPER/GPR30) in ovarian granulosa cell tumors[J].Int J Mol Sci,2014,15(9):15161-15172.

[9] Boscia F,Passaro C,Gigantino V,et al.High levels of GPR30 protein in human testicular carcinoma in situ and seminomas correlate with low levels of estrogen receptor-beta and indicate a switch in estrogen responsiveness[J].J Cell Physiol,2015,230(6):1290-1297.

[10] Arias-Pulido H,Royce M,Gong Y,et al.GPR30 and estrogen receptor expression: new insights into hormone dependence of inflammatory breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat,2010,123(1):51-58.

[11] Skrzypczak M,Schüler S,Lattrich C,et al.G protein-coupled estrogen receptor (GPER) expression in endometrial adenocarcinoma and effect of agonist G-1 on growth of endometrial adenocarcinoma cell lines[J].Steroids,2013,78(11):1087-1091.

[12] Méndez-Luna D,Martínez-Archundia M,Maroun RC,et al.Deciphering the GPER/GPR30-agonist and antagonists interactions using molecular modeling studies,molecular dynamics,and docking simulations[J].J Biomol Struct Dyn,2015,33(10):2161-2172.

[13] Kolkova Z,Noskova V,Ehinger A,et al.G protein-coupled estrogen receptor 1 (GPER,GPR 30) in normal human endometrium and early pregnancy decidua(dagger)[J].Mol Hum Reprod,2010,16(10):743-751.

[14] Ge X,Guo R,Qiao Y,et al.The G protein-coupled receptor GPR30 mediates the nontranscriptional effect of estrogen on the activation of PI3K/Akt pathway in endometrial cancer cells[J].Int J Gynecol Cancer,2013,23(1):52-59.

[15] Vivacqua A,Romeo E,De Marco P,et al.GPER mediates the Egr-1 expression induced by 17β-estradiol and 4-hydroxitamoxifen in breast andendometrial cancer cells[J].Breast Cancer Res Treat,2012,133(3):1025-1035.

[16] 叶佳,张沐,马勤宜,等.G蛋白偶联受体30在子宫内膜癌Ishikawa细胞中的表达及亚细胞定位[J].肿瘤,2011,31(11):977-981.

南通市科技计划项目(K2010043)；南通大学研究生科技创新计划项目(YKC11013)。

张玉泉(E-mail: jsnt_zhangyuquan@163.com)

*现工作于南京医科大学附属无锡人民医院。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.19.010

R711.74

A

1002-266X(2016)19-0031-03

2016-02-14)