Notch1基因沉默的人绒毛膜上皮癌细胞增殖及侵袭能力变化

刘绍晨，许倩，李健会

(河北承德医学院基础医学院病理教研室，河北承德067000)



Notch1基因沉默的人绒毛膜上皮癌细胞增殖及侵袭能力变化

刘绍晨，许倩，李健会

(河北承德医学院基础医学院病理教研室，河北承德067000)

目的观察Notch1基因沉默后人绒毛膜上皮癌细胞增殖及侵袭能力变化。方法查阅GenBank提供的Notch1序列(NM-001105721.1)设计引物，合成Notch1 siRNA。分离培养人绒毛膜上皮癌JEG-3细胞，分为A、B、C组。A组不做转染，B组转染control siRNA，C组转染Notch1 siRNA。分别于转染后12、24、36、48、60 h采用MTT法检测各组细胞增殖能力(OD值)。转染后48 h采用Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力。转染后72 h采用Western blotting法检测各组细胞中的MMP-2、MMP-9蛋白。结果转染后36、48、60 h C组OD值低于A、B组(P均<0.05)。A、B、C组穿膜细胞数分别为(109±6)、(118±7)、(59±4)个，C组与A、B相比，P均<0.05。A、B、C组细胞中MMP-2蛋白相对表达量分别为0.91±0.08、0.87±0.01、0.29±0.05，MMP-9蛋白相对表达量分别为0.85±0.04、0.79±0.03、0.35±0.05，C组MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量与A、B组相比，P均<0.05。结论Notch1基因沉默后，人绒毛膜上皮癌细胞增殖受到抑制，侵袭能力减弱。

绒毛膜上皮癌；Notch1基因；RNA干扰技术

绒毛膜上皮癌是一种高度恶性的滋养细胞肿瘤，早期即可发生血行转移，目前总体疗效不满意，患者5年生存率仅为43%[1,2]。近年来分子靶向治疗日益受到关注[3]，其在发挥更强抗肿瘤活性的同时减小了对正常细胞的毒性作用。Notch信号通路在细胞增殖、分化及凋亡中发挥重要作用，且与多种肿瘤的发生、发展密切相关。Pang等[4]研究表明，Notch1可增强滋养细胞的侵袭能力。Cobellis等[5]发现VEGF表达减少导致Notch蛋白表达下调，影响滋养细胞对子宫内膜的可控性侵袭，与子痫前期发病有关。Notch信号通路可能参与了绒毛膜癌的发生。2014年6月～2015年10月，本研究借助RNA干扰(RNAi)技术沉默人绒毛膜上皮癌细胞中Notch1基因表达，并观察了细胞增殖及侵袭能力变化，现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验细胞与材料人绒毛膜上皮癌JEG-3细胞系购自中国科学院动物研究所计划生育与生殖生物学国家重点实验室，胎牛血清购自杭州四季青生物公司，DMEM、MTT购自美国Gibco BRL公司，HERAcell 150型CO2培养箱购自德国Heraeus公司。

1.2细胞培养与分组JEG-3细胞常规复苏后，置于含10%胎牛血清、2 mmol/L谷丙酰胺、1 mmol/L丙酮酸钠的DMEM培养液中，37 ℃、5% CO2条件下培养。3次传代稳定后用于实验。将细胞分为A、B、C组。

1.3Notch1 siRNA序列合成与转染查阅GenBank提供的Notch1序列(NM-001105721.1)设计引物，由上海吉玛公司合成。Notch1 siRNA序列为5′-CCGCCTTTGTGCTTCTGTT-3′，control siRNA序列为5′-UUTUCGCAUCGAGUCACGUCT-3′。将处于对数生长期的各组细胞用胰酶消化，按2×105/孔接种于6孔板，加入无双抗DMED培养基，细胞密度为60%。A、B、C组分别加入Opti-MEM培养基/LipofcctamieTM2000复合物、control siRNA/LipofcctamieTM2000复合物和Notch1 siRNA/LipofcctamieTM2000复合物，培养6 h后换DMEM完全培养基继续培养48～72 h，之后消化吸收细胞备用。Western blotting法检测各组Notch1蛋白，结果显示C组Notch1蛋白表达水平低于A、B组。

1.4细胞增殖能力检测分别于转染后12、24、36、48、60 h测定细胞增殖能力。将各组对数生长期细胞以1×104/孔接种于96孔板内，过夜培养。将各融合蛋白稀释加入孔中，A组加入NusA，37 ℃培养，各孔加20 μL MTT溶液，室温反应4 h后弃上清，再加入150 μL DMSO，震荡10 min，溶解结晶。使用酶标仪测定490 nm波长光密度值(OD值)，代表细胞增殖能力。

1.5细胞侵袭能力检测包被基底膜，将Matrigel胶与无血清DMEM培养基稀释(比例为1∶8)，取50 μL加入Transwell小室上室，风干。水化基底膜，弃培养板中的残留液体，加入50 μL无血清培养液。收集转染48 h后的各组细胞，用含10 g/L 牛血清白蛋白(BSA)的无血清DMEM培养基重悬，使细胞密度为1×105/mL。接种200 μL细胞悬液到上室中，将小室置于含20%胎牛血清DMEM培养液的24孔板，孵育24 h，PBS淋洗，擦掉上室内细胞，PBS洗3次，95%乙醇固定，结晶紫染色，倒置显微镜下(200×)随机选取5个视野，计数穿过小室膜孔的细胞。

1.6细胞中MMP-2及MMP-9蛋白检测收集转染72 h后的细胞，采用Western blotting法检测各组细胞中的MMP-2、MMP-9蛋白，按试剂盒说明书操作。图像分析软件分析灰度值，表示蛋白相对表达量。

2　结果

2.1各组细胞增殖能力比较转染后36、48、60 h C组OD值低于A、B组(P均<0.05)。见表1。

表1　各组转染后不同时间OD值比较±s)

注：与A、B组相比，*P<0.05。

2.2各组细胞侵袭能力比较A、B、C组穿膜细胞数分别为(109±6)、(118±7)、(59±4)个，C组与A、B相比，P均<0.05。

2.3各组细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达比较A、B、C组细胞中MMP-2蛋白相对表达量分别为0.91±0.08、0.87±0.01、0.29±0.05，MMP-9蛋白相对表达量分别为0.85±0.04、0.79±0.03、0.35±0.05，C组MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量与A、B组相比，P均<0.05。

3　讨论

滋养层细胞在正常妊娠时呈现类似恶性肿瘤的特性，区别在于滋养层细胞对子宫内膜组织的侵入受到严格调控，当调控出现紊乱时，则可能导致绒毛膜癌的发生。目前发现多种细胞因子及信号通路参与绒毛膜癌细胞的转移侵袭[6～8]。Notch信号通路与肿瘤关系密切，在肿瘤发生、发展及耐药形成中均发挥重要作用。Notch1是肿瘤组织中最常表达的Notch家族成员之一，Notch1参与消化系统肿瘤的发生发展[9～11]。研究[12～15]表明，Notch1信号通路相关基因突变是急性T淋巴细胞白血病发生的关键诱因。在细胞的增殖、凋亡及分化过程中，也有Notch1信号通路的参与[16～19]。

RNAi技术是通过siRNA介导、在mRNA水平将相应序列基因关闭或沉默的过程，稳定性、特异性高，成功率高，近年来被广泛应用于细胞信号转导及基因表达研究领域。我们通过siRNA技术沉默JEG-3细胞中Notch1基因表达，结果显示C组Notch1蛋白表达水平低于A、B组，提示通过RNAi技术沉默Notch1基因表达成功。C组转染后36、48、60 h细胞增殖能力低于A、B组，转染后48 h C组穿膜细胞数少于A、B组，提示沉默Notch1基因表达可抑制JEG-3细胞增殖。

一项胰腺癌相关研究结果显示，上调Notch1基因表达可活化NF-κB信号通路，使MMP-9表达增高，促进肿瘤的浸润转移；而应用siRNA技术沉默Notch1基因后，则有抑制肿瘤侵袭的效果。Notch1信号通路可能通过调控MMP-9表达从而调节胰腺癌细胞的侵袭过程。目前普遍认为，细胞间黏附力降低和基底膜、细胞外基质降解是肿瘤细胞侵袭转移的重要步骤。MMP不仅可以降解细胞外基质，还可结合并活化肿瘤细胞膜上的跨膜蛋白，从而促进肿瘤细胞侵袭转移。我们通过Transwell侵袭实验发现，C组穿膜细胞数较A、B明显减少，且细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达下调，提示Notch1沉默后JEG-3细胞侵袭能力减弱，可能是通过下调MMP-2、MMP-9表达实现的。

结合上述研究结果，我们认为，Notch1沉默后人绒毛膜上皮癌细胞增殖受到抑制，细胞侵袭能力减弱，Notch信号通路有望成为人绒毛膜上皮癌新的治疗靶点。

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Changes in proliferation and invasive abilities of human chorionic epithelioma cells after silencing Notch1 gene

LIU Shaochen,XU Qian,LI Jianhui

(Pathology and Pathophysiology of Hebei Chengde Medical College,Chengde 067000,China)

ObjectiveTo observe the changes in the proliferation and invasive abilities of human chorionic epithelioma cells after silencing Notch1 gene.MethodsWe looked up Notch1 sequence (NM 001105721.1) design primers provided by Genbank to synthesize Notch1 siRNA.Human chorionic epithelioma cells JEG-3 were cultivated and divided into groups A,B and C.The group B was transfected by control siRNA,group C was transfected by Notch1 siRNA and group A without any transfection.12,24,36,48,60 hours after transfection,the cell proliferation ability was determined by MTT in each group,and the invasion ability was detected by Transwell invasive experiment.The expression of MMP-2 and MMP-9 protein was detected by Western blotting 72 h after transfection.ResultsThe cell proliferation ability of group C at 36 h,48 h and 60 h after transfection was lower than those of groups A and B (all P<0.05).The number of cells penetrating the membrane in the groups A,B and C were 109±6,118±7 and 59±4; significant difference was found between group C and groups A and B (all P<0.05).The relative expression of MMP-2 of groups A,B and C was 0.91±0.08,0.87±0.01 and 0.29±0.05,respectively.The relative expression of MMP-9 of groups A,B and C was 0.85±0.04,0.79±0.03 and 0.35±0.05,respectively.The expression of MMP-2 and MMP-9 in the group C was lower than that of groups A and B (all P<0.05).ConclusionThe cell proliferation of human chorionic epithelioma is inhibited and the invasive ability is decreased after silencing Notch1 gene.

chorionic epithelioma; Notch1 gene; RNA interference

河北省高等学校科学研究计划项目(QN2014011)；河北省病理学与病理生理学重点学科；河北省人口和计划生育委员会科技研究计划项目(ZL20140231)。

刘绍晨(1976-)，男，讲师，主要研究方向为肿瘤病理学。E-mail：liusgaochen6666@126.com

刘绍晨

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.19.004

R737.3

A

1002-266X(2016)19-0012-03

2015-11-30)