不同浓度柚皮苷对人宫颈癌HeLa细胞体外增殖及其COX-2表达影响①

杨文静　王　璐　孙　锐

(江汉大学附属医院妇产科，武汉430015)



不同浓度柚皮苷对人宫颈癌HeLa细胞体外增殖及其COX-2表达影响①

杨文静王璐孙锐②

(江汉大学附属医院妇产科，武汉430015)

①本文为武汉市卫计委临床医学科研项目(WX15D59)、武汉市科技局科技攻关项目(No.2015061701011626)和武汉市卫生与计划生育委员会重点项目(No.WX15A08)。

②华中科技大学同济医学院附属普爱医院肿瘤科，武汉430033。

目的：研究柚皮苷对人宫颈癌Hela细胞体外增殖的影响及相关机制研究。方法：用不同浓度的柚皮苷处理体外培养人宫颈癌Hela细胞，采用MTT法检测处理24、48、72 h后Hela细胞的增殖情况，流式细胞仪测定细胞凋亡率，Hoechst 33258染色观察细胞凋亡情况，同时Western blot观察环氧合酶-2(COX-2)表达的相对量。结果：与对照组相比，柚皮苷低剂量组细胞抑制率无显著差异(P>0.05)，柚皮苷中剂量组和高剂量组细胞抑制率显著增高(P<0.05)；柚皮苷低剂量组细胞凋亡率无显著差异(P>0.05)，柚皮苷中剂量组和高剂量组细胞凋亡率显著增高(P<0.05)，同时柚皮苷中剂量和高剂量组可观察到明显的细胞凋亡现象；柚皮苷低剂量组细胞COX-2表达的相对量无显著差异(P>0.05)，柚皮苷中剂量组和高剂量组细胞COX-2表达的相对量显著降低(P<0.05)；结论：柚皮苷能抑制宫颈癌细胞生长，且随其浓度增加抑制作用增强，其机制可能与其抑制COX-2蛋白表达，促进细胞凋亡相关。

柚皮苷；HeLa细胞；增殖；环氧化酶-2

子宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，在全球妇女恶性肿瘤中居第二位，仅次于乳腺癌。Cuzick等研究报道该病的80%病例在发展中国家，而我国占世界新发病例的28%[1]。目前对于子宫颈癌的治疗主要采取手术、放疗和化疗，但对于其发生、发展以及治疗后的不良反应等仍然存在很多问题，因此对子宫颈癌的机制研究和治疗新的手段得到了重视。柚皮苷是一类天然黄酮化合物，来源于芸香科柑橘属植物柚，葡萄柚的未成熟或近成熟的干燥外层果皮中提取出的淡黄色的双氢黄酮类化合物。游琼等[2]研究表明，柚皮苷除了具有抗病毒、镇静、镇痛等作用外还具有预防癌症的作用。同时Diane等[3]研究表明黄酮类化合物能通过诱导细胞凋亡、增强抑癌基因表达等方式产生抗肿瘤作用。嗣后，宋淑慧研究发现柚皮苷对人卵巢癌SKOV3细胞体外增殖具有显著抑制作用，且其相关机制可能与环氧合酶-2(COX-2)的表达有关。黄酮类化合物对细胞的抗凋亡作用越来越受到重视，关于柚皮苷对细胞凋亡和癌变的化学和物理因素进行许多研究[4-8]。故本文以体外培养人宫颈癌Hela细胞为研究对象，通过MMT法等观察其增殖和凋亡情况，同时检测COX-2的表达以探索其作用的相关机制，为今后人宫颈癌的治疗和研究提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1药物与试剂柚皮苷、二甲基亚(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)和Hoechst33258均购于Sigma公司；细胞凋亡检测ELISA试剂盒购于Roche公司；兔人抗COX-2购于Santa Cruz公司。细胞：人宫颈癌Hela细胞购于上海中科院细胞库。

1.1.2仪器超净工作台(苏州安泰生物技术有限公司)；细胞培养箱(美国ThermoScientific)；超速低温离心机(美国Beckman公司)； EBICS-XL流式细胞检测仪(美国贝克曼)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；垂直凝胶电泳仪(美国佰乐)；酶标仪(美国ThermoScientific)。

1.2方法将HeLa细胞置于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。培养液含10%小牛血清的RPMI1640，按照细胞的生长进行接种。当细胞生长状态稳定、呈对数生长期时才进行实验。

1.2.1MTT法检测人宫颈癌HeLa细胞抑制率按1×104/孔密度将对数生长期的人宫颈癌HeLa细胞接种于96孔板，分成4组，即对照组，柚皮苷低、中、高剂量组，每组10孔。孵育24 h后，吸出原培养液，对照组加入100 μl的RPMI1640溶液，柚皮苷低、中、高剂量组中分别加入含柚皮苷浓度为40、80、100 μmol/L的RPMI1640溶液100 μl。孵育24、48、72 h后，每孔分别加入50 μl MMT溶液。继续孵育4 h后，终止培养。吸取孔内上清液，弃之，加入DMSO 150 μl，震摇10 min，用酶标仪在490nm处测定各孔的吸光度OD。细胞增殖抑制率=(1-给药组OD /对组OD)×100%。

1.2.2细胞凋亡率的检测同前法将细胞培养、分组以及给予不同浓度的柚皮苷处理，按照细胞凋亡试剂盒的操作说明采用流式细胞术检测细胞凋亡率。

1.2.3Hoechst 33258染色按1×105/孔密度将对数生长期的人宫颈癌HeLa细胞接种于35 mm的培养皿中，分成4组，即对照组，柚皮苷低、中、高剂量组，每组10孔。各组给予不同浓度的柚皮苷，在37℃、5%CO2孵箱中培养，48 h。用4%的多聚甲醛固定细胞，4℃固定15 min。去掉固定液，用PBS洗两遍，每次3 min。加5 mg/ml的Hoechst33258染色液，室温放置10 min。倒掉染色液，用PBS洗3遍，每次3 min，避光风干。在荧光倒置显微镜下观察。

1.2.4Western blot法对COX-2表达检测分别取各组人宫颈癌HeLa细胞，用蛋白裂解液充分的裂解细胞；离心，取上清提取总蛋白；采用酚试剂法进行对蛋白定量；采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和电转仪将蛋白转印至PVDF 膜，封闭，过夜；按说明书要求加入待检测的一抗以及相应的二抗，显色，扫描测定杂交带的灰度值，用目的蛋白活性片段与内参β-肌动蛋白灰度值的相对比值代表各COX-2活化蛋白的相对含量。

2　结果

2.1柚皮苷对人宫颈癌HeLa细胞抑制率影响由表1知，与空白组相比，低剂量组在24、48、72 h时人宫颈癌HeLa细胞抑制率均无显著性差异(P>0.05)；中剂量组在24、48、72 h时人宫颈癌HeLa细胞抑制率均显著性增高(P<0.05)；高剂量组在24、48、72 h时人宫颈癌HeLa细胞抑制率均显著性增高(P<0.05)。提示，柚皮苷对人宫颈癌HeLa细胞具有显著的抑制作用，且强度随浓度的增加而增强，同时还对时间有一定的依懒性。

2.2柚皮苷对人宫颈癌HeLa细胞凋亡影响由表2和图1知，与空白组相比，低剂量组人宫颈癌HeLa细胞凋亡率无显著性差异(P>0.05)；中剂量组人宫颈癌HeLa细胞凋亡率显著性增高(P<0.05)；高剂量组人宫颈癌HeLa细胞凋亡率显著性增高(P<0.05)。

表1　柚皮苷对人宫颈癌HeLa细胞抑制率影响结果±s)Tab.1　Effects of naringin on growth inhibition ratio of human cervical cancer HeLa ±s)

表2　柚皮苷对人宫颈癌HeLa细胞凋亡率结果±s)Tab.2　Effects of naringin on apoptosis ratio of human cervical cancer HeLa ±s)

图1　流式细胞仪检测柚皮苷对HeLa细胞凋亡率的影响Fig.1　Effects of naringin on apoptosis ratio of human cervical cancer HeLa cellNote: A.Control group;B.Low dose group;C.Middle dose group;D.High dose group.

图2　各组在荧光显微镜下人宫颈癌Hela细胞Fig.2　Morphological changes of human cervical cancer HeLa cell induced by naringin

2.3Hoechst33258染色结果由图2可知，在荧光显微镜下，对照组和低剂量组中Hela细胞膜完整，细胞核大， 胞核极显清楚，呈椭圆形或圆形，核内荧光较弱，染色部分为均一的淡蓝色，而中剂量组的Hela细胞可见部分细胞核体积减小，细胞核由于浓缩、着色深而呈亮蓝色，其染色质分布不均匀，部分细胞核呈颗粒团状分布，细胞核呈现不同程度的早期凋亡特征；当给药浓度继续增加，即在高剂量组可知，细胞核裂解为碎块，典型的呈梅花瓣状，产生凋亡小体，甚至溶解消失，呈现出晚期凋亡和坏死的细胞核特征。

2.4柚皮苷对各组细胞COX-2蛋白表达的影响由表3知，与空白组相比，低剂量组COX-2蛋白相对表达量无显著性差异(P>0.05)；中剂量组COX-2蛋白相对表达量显著性降低(P<0.05)；高剂量组COX-2蛋白相对表达量显著性降低(P<0.05)。

表3　柚皮苷对COX-2蛋白相对表达量结果±s)Tab.3　Naringin ameliorates expression of COX-2 in HeLa ±s)

3　讨论

目前对于子宫颈癌的治疗主要采取手术、放疗和化疗，但对于其发生、发展以及治疗后的不良反应等仍然存在很多问题，因此发展新的治疗手段不断得到人们的重视。现文献研究中多以体外培养细胞为对象，通过给予不同的药物处理探索其药理作用，同时检测其特定的靶向物质来研究其可能的相关机制。如宋淑慧研究发现柚皮苷对人卵巢癌SKOV3细胞体外增殖具有显著抑制作用，且其相关机制可能与COX-2的表达有关；米合勒阿衣·艾克帕等[9]研究了异常黑胆质成熟剂总黄酮对人宫颈癌Hela细胞增殖的影响，结果表明异常黑胆质成熟剂总黄酮能显著抑制人宫颈癌Hela细胞增殖，其可能机制是增强其抗氧化能力。反之，我们又可以通过相关机制来预测新的治疗方法，程金龙等[10]研究宫颈癌与鳞状细胞癌抗原(SCCA)和环氧合酶-2(COX-2)之间的敏感性和相关性，预测出宫颈癌新辅助化疗法。本文以体外培养人宫颈癌Hela细胞为研究对象，通过MMT法等观察其增殖和凋亡情况，同时检测COX-2的表达以探索其作用的相关机制。

本文首先采用MTT法检测各组HeLa细胞给予不同浓度的柚皮苷后的24、48、72 h后的增殖情况，结果表明中剂量组和高剂量组的HeLa细胞抑制率显著增高，提示柚皮苷对人宫颈癌HeLa细胞具有显著的抑制作用，且强度随浓度的增加而增强，同时还对时间有一定的依懒性。进一步采用流式细胞仪测定细胞凋亡率和Hoechst 33258染色，结果发现低剂量组人宫颈癌HeLa细胞凋亡率无显著性差异，而中剂量组和高剂量组人宫颈癌HeLa细胞凋亡率显著性增高，且中剂量组和高剂量组的人宫颈癌HeLa细胞呈现明显的凋亡现象。以上结果表明柚皮苷对体外人宫颈癌HeLa细胞有明显的抑制作用，且作用随浓度的增加而增强和对时间具有一定的依懒性。最后本文还采用Western blot法对COX-2相对量表达进行检测以探索相关机制，结果表明低剂量组COX-2蛋白相对表达量无显著性差异，中剂量组和高剂量COX-2蛋白相对表达量显著性降低。环氧合酶是花生四烯酸转化为各种前列腺素的关键酶，Menczer等[10]研究表明COX-2为一种诱导酶，它参与体内多种病理生理过程，可以被一些肿瘤促进因子和癌基因诱导。COX-2参与肿瘤的发生、转移、预后的机制可能主要为以下几方面：促进细胞凋亡；促进机体的抗肿瘤免疫；抑制成肿瘤新生血管；抑制肿瘤的侵袭和转移。近来研究表明COX-2在结肠癌、胃癌等癌组织中呈现较高的表达，而COX-2抑制剂对体外癌细胞具有显著的抑制增殖和诱导细胞凋亡作用[11，12]。嗣后，马雪莲等[13，14]研究表明，COX-2选择性抑制剂能诱导癌细胞凋亡，从而抑制癌细胞增长，同时与化疗和放疗有一定的协同作用。结合本文研究结果表明，中剂量和高剂量柚皮苷对COX-2的相对表达量具有显著的抑制作用，提示柚皮苷可作为COX-2抑制剂抑制人宫颈癌HeLa细胞的增殖，这可能是其机制之一。

综上所述，柚皮苷对体外人宫颈癌HeLa细胞有明显的抑制作用，且作用随浓度的增加而增强和对时间具有一定的依懒性；其作用机制可能与抑制COX-2的相对表达量有关。

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[收稿2015-12-15修回2016-03-09]

(编辑张晓舟)

Effects of naringin on growth and COX-2 expressions in human cervical cancer HeLa cell line

YANG Wen-Jing,WANG Lu,SUN Rui.Obstetrics and Gynecology，Affiliated Hospital of the Jianghan University，Wuhan 430015，China

Objective:To study the effect of naringin on human cervical cancer HeLa cell line and its related mechanism.Methods: HeLa cells were cultured in vitro in the presence of different concentration naringin.The method of MTT was used to detect the growth of HeLa cell in 24 h,48,72 h.Apoptotic cells were observed by Hoechst 33258 staining.The protein expressions of COX-2 in SCL-12 cells were analyzed by Western blot.Results: The inhibition ratio of the cell growth in middle dose group and high dose group significantly higher than control group(P<0.05) and the inhibition ratio in low dose group was no significant change(P>0.05).The apoptosis ratio of the cell growth in middle dose group and high dose group significantly higher than control group(P<0.05) and the apoptosis ratio in low dose group was no significant change(P>0.05).The expression of COX-2 was significantly decreased in middle dose group and high dose group.Conclusion: Naringin plays a central role in the apoptosis of the human cervical cancer HeLa cell line,which may be related to the expression of COX-2.

Naringin;HeLa cell;Growth;COX-2

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.026

R739.5文献标志码A

1000-484X(2016)08-1200-04

杨文静(1981年-)，女，硕士，主治医师，主要从事妇科肿瘤方面的研究，E-mail：yangwenjing999000@163.com。

及指导教师：孙锐(1988年-)，男，博士，主治医师，主要从事肿瘤的免疫调节及综合治疗方面的研究。