磁微粒化学发光法与酶联免疫吸附法测定抗中性粒细胞胞浆抗体的结果比较

张立娟

(航空总医院检验科，北京100012)



磁微粒化学发光法与酶联免疫吸附法测定抗中性粒细胞胞浆抗体的结果比较

张立娟

(航空总医院检验科，北京100012)

目的：比较分析磁微粒化学发光法与酶联免疫吸附法测定抗PR3抗体、抗MPO抗体的检测结果。方法：分别采用磁微粒化学发光法(A方法)和酶联免疫吸附法(B方法)对166例自身免疫病患者血清、50例健康者血清中抗PR3抗体、抗MPO抗体进行定量检测，对检测结果进行统计分析。结果：A方法测定高、中、低质控血清的批内和批间重复性优于B方法，A、B方法测定质控血清的准确度均符合要求；A、B方法测定抗PR3抗体、抗MPO抗体临床样本的线性相关系数r分别为0.987 8，0.989 6；A、B方法的检测结果采用kappa分析，kappa系数分别为0.897和0.882。结论：磁微粒化学发光法(A方法)测定抗PR3抗体、抗MPO抗体优于酶联免疫吸附法(B方法)，更符合临床应用要求。

抗中性粒细胞胞浆抗体；髓过氧化物酶；蛋白酶3；酶联免疫吸附法；磁微粒化学发光法

抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)是能与中性粒细胞胞浆中的颗粒成分以及单核细胞内的溶酶体反应的一组自身抗体，其本质是免疫球蛋白[1]。根据间接免疫荧光法(IIF)阳性荧光区域的差异，可分为胞浆型ANCA(cNACA)和核周型ANCA(pANCA)，相应的主要靶抗原分别为PR3和MPO[2]。抗PR3抗体和抗MPO抗体主要与系统性血管炎相关，可作为系统性小血管炎的特异性血清学诊断指标[3]。目前定量测定抗PR3抗体和抗MPO抗体均采用ELISA方法，磁微粒化学发光法是近几年快速发展的检测方法，具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、简单快速、安全无毒等优点。本研究采用磁微粒化学发光法和酶联免疫吸附法分别测定临床不同人群抗PR3抗体和抗MPO抗体，并将两种方法学测得的结果进行了比较，报告如下。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1临床样本166例自身免疫性疾病患者均为航空总医院门诊、住院确诊病例，其中确认韦格纳肉芽肿(WG)86例、显微镜下多动脉炎(MPA)28例，Churg-Strauss综合征52例，临床诊断符合国内或国际的相应诊断标准。收集50例健康人群血清作为正常对照组。

选取无溶血、乳糜、黄疸及细菌污染的高、中、低值3例血清作为质控血清，分装后冷冻保存。每次检测前取1支室温融化备用，考察两种检测方法的重复性和准确度。

1.1.2仪器及试剂全自动化学发光免疫分析仪(北京中航赛维生物科技有限公司)；全自动酶联免疫分析仪(意大利ELese)。抗髓过氧化物酶抗体(Anti-MPO)测定试剂盒(磁微粒化学发光法)、抗蛋白酶3抗体(Anti-PR3)测定试剂盒(磁微粒化学发光法)由北京中航赛维生物科技有限公司提供。抗髓过氧化物酶抗体检测试剂盒(ELISA)、抗蛋白酶3抗体检测试剂盒(ELISA)购自欧蒙医学实验诊断股份公司。

1.2方法

1.2.1磁微粒化学发光法(A方法)按照全自动操作流程测试样本，由软件自动显示测试结果。抗PR3抗体和抗MPO抗体正常参考值均为0～20 RU/ml，超过20 RU/ml则判为阳性结果。

1.2.2酶联免疫吸附法(B方法)参照说明书进行操作，简要步骤如下:待测血清使用样本稀释液以1∶101稀释，加样量为100 μl，根据微孔板定标曲线计算待测血清相应抗体浓度，当抗PR3抗体和抗MPO抗体浓度≥20 RU/ml，判定为阳性结果。

1.3统计学处理

1.3.1使用SPSS18.0软件对两种方法测定抗PR3抗体和抗MPO抗体质控血清的批内和批间变异系数进行成对样本的t检验。

1.3.2以酶联免疫吸附法(ELISA)为比较方法(X)，磁微粒化学发光法(CMIA)为实验方法(Y)，分别计算两种方法测定抗PR3抗体和抗MPO抗体临床血清的线性回归方程和相关系数r。

1.3.3使用SPSS18.0软件对两种方法测定抗PR3抗体和抗MPO抗体临床血清的阴阳性符合情况进行Kappa分析。

2　结果

2.1批内和批间重复性选取低、中、高三个不同浓度的质控血清，每份血清连续重复检测10次，分别计算各测定结果的均值、标准差以及批内的变异系数，结果：测试抗PR3抗体，使用A方法检测3份血清标本的批内变异系数分别为5.48%、4.22%、3.65%(见表1)；使用B方法检测批内变异系数分别为8.73%、7.18%、5.67%(见表2)。测试抗MPO抗体，使用A方法检测3份血清标本的批内变异系数分别为5.52%、4.78%、4.29%(见表3)；使用B方法检测批内变异系数分别为8.50%、6.39%、6.16%(见表4)。同期进行抗PR3抗体和抗MPO抗体批间试验，每天1次、连续测定10 d后，使用A方法测定抗PR3抗体求出三份血清标本的批间变异系数分别为7.87%、6.55%、6.07%(见表1)，使用B方法测试批间变异系数分别为10.84%、8.54%、7.67%(见表2)，测试抗MPO抗体使用A方法求出三份血清标本的批间变异系数分别为8.19%、7.34%、5.93%(见表3)，使用B方法测试批间变异系数分别为9.28%、8.32%、6.81%(见表4)。A方法与B方法比较，测定抗PR3抗体、抗MPO抗体批内和批间重复性的差异具有统计学意义(P<0.05)，即认为A方法测定结果的批内和批间重复性优于B方法。

2.2准确度在高、中、低三个不同标本中分别加入一定浓度的定标液，比较理论值和检测值，按下列公式计算回收率：回收率= 检测值/理论值×100%，A方法回收率在96%～105%之间，平均回收率99.2%，B方法回收率93%～101%，平均回收率97.7%，两者均符合回收率的要求。

表1　A方法检测抗PR3抗体质控血清结果(n=10)Tab.1　Anti-PR3 concentration of control serum deter-mined by method A(n=10)

表2　B方法检测抗PR3抗体质控血清结果(n=10)Tab.2　Anti-PR3 concentration of control serum deter-mined by method B(n=10)

表3　A方法检测抗MPO抗体质控血清结果(n=10)Tab.3　Anti-MPO concentration of control serum deter-mined by method A(n=10)

表4　B方法试剂盒检测抗MPO抗体质控血清结果(n=10)Tab.4　Anti-MPO concentration of control serum deter-mined by method B(n=10)

图1　两种方法测试抗PR3抗体及抗MPO抗体线性相关性结果Fig.1　Linear correlation between two methods testing Anti-PR3 and Anti-MPO

表5　两种方法测定抗PR3抗体结果的一致性Tab.5　Consistency of Anti-PR3 tested between two methods

2.3检测结果的相关性分析将两种方法测定抗PR3抗体(WG患者86例，健康人群50例，共计136例血清样本)、抗MPO抗体(MPA患者28例，Churg-Strauss综合征患者52例，健康人群50例，共计130例血清样本)的结果进行线性相关分析，结果两种方法测试抗PR3抗体相关系数r=0.987 8,测试抗MPO抗体相关系数r=0.989 6，两种方法测试结果具有高度的相关性。见图1。

2.4检测结果的一致性将两种方法测定抗PR3抗体(136例血清样本)和抗MPO抗体(130例血清样本)的测试结果转化为阴阳性符合情况，进行Kappa一致性分析，两种方法测试结果显示出高度一致性，Kappa系数分别为0.897，0.882，结果见表5、6 。

表6　两种方法测定抗MPO抗体结果的一致性Tab.6　Consistency of Anti-MPO tested between two methods

3　讨论

原发性小血管炎是目前尚未明确病因的一组小血管炎，研究认为该类疾病的发生可能是在某些遗传背景下由某些环境因素诱发的。主要侵犯小动脉、微动脉等，表现为血管壁坏死性炎症、纤维素样坏死等病理特征，属于一类自身免疫疾病[4]，20世纪80年代后期的大量研究表明，ANCA对原发性小血管炎的协助诊断、判断疗效、预测复发等均具有重要意义[5]。抗PR3抗体阳性多见于活动性韦格纳氏肉芽肿。抗MPO抗体阳性主要见于特发性坏死性新月体性肾小球肾炎(NCGN)、显微镜下多动脉炎( MPA) 、Churg-Strauss综合征(CSS) 、结节性多动脉炎(PAN) 、系统性红斑狼疮(SLE) 、类风湿关节炎(RA) 、干燥综合征(SS) 、系统性硬化症(SSc) 等[6]。

经典的ANCA检测方法为间接免疫荧光法，但该方法为定性检测，操作复杂且主观性高，目前临床采用的其他定性方法还包括免疫印迹法(IB)、斑点杂交法(dotblotting)、流式细胞法(FCM)等[7]。目前临床采用的定量方法均为酶联免疫吸附法(ELISA)，但也有其局限性：如固/液反应接触面积小，反应不彻底，测量结果变异系数大，灵敏度较低等[8]。磁微粒化学发光法将化学发光分析技术与磁性微粒分离技术相结合，在可操作性、准确度、重复性、灵敏度和特异性等方面都有了全面提高。

从本实验结果来看，针对抗PR3抗体和抗MPO抗体的质控血清测试，磁微粒化学发光法的批内、批间重复性都优于酶联免疫吸附法，并且准确度符合要求，说明在保证测量结果可靠的前提下，磁微粒化学发光法的可重复性更好；二者检测相同临床标本的相关性分析r>0.9，说明两种方法的测定结果相关性较好；测试结果统计阴阳性符合情况，计算出的kappa系数分别为0.897、0.882，说明两种方法的测试结果具有高度一致性。应用全自动化学发光免疫分析仪采用磁微粒化学发光法检测抗PR3抗体和抗MPO抗体，仪器自动完成样品的稀释、加样、检测和结果的输出，步骤和方法简单易行，便于操作，大幅度减少了医院检验科的工作量；由于仪器自动储存标准曲线，不仅可以实现批量检测，同时还可以完成单个样本随时上机测定，避免了酶联免疫吸附法不能进行单个样本检测的不足，极大满足临床患者的需求。目前酶联免疫吸附法定量测定上述两种自身抗体，反应时间通常为1.5～2 h，而磁微粒化学发光法反应时间仅需半小时左右，反应时间大大缩短，可以更快地给出测定结果，减少临床医生和患者等待的时间。同时，磁微粒化学发光法的免疫反应在准液相条件下进行、反应时间短，可以尽可能地避免固/液反应非特异性吸附和非特异性分子的结合，提高反应的特异性和精度。由此可见，磁微粒化学发光法检测抗PR3抗体和抗MPO抗体，能够更好地满足临床应用的要求，与酶联免疫吸附法相比，在ANCA相关疾病的诊断方面更上一个新的台阶。

[1]Alpa M,Ferrero B,Cavallo R,etal.Anti-GML and anti-sulphatide antibodies in systemic idiophatic vasculitis，systemic lupus erythematosus and mixed cryoglobulinaemia:serum detection and clinical and electro-physiologic correlations [J].G Ital Nefrol,2002,19(6):617-621.

[2]谭立明，彭卫华，徐承运，等.抗PR3抗体和抗MPO 抗体的检测及临床研究[J].中华风湿学杂志，2004，8(9)：8-9.

[3]马荣，王卫东，郑永胜，等.抗PR3抗体、抗MPO抗体检测的临床探究[J]. 大连医科大学学报，2007，29(4)：385-386.

[4]Falk RJ,Jennette JC.Thoughts about the classification of small vessel vasculitis[J].J Niphrol,2004,17 suppl8(6):S3-9.

[5]张玲，吴丽华，肖晗，等.抗-ANCA、抗-ACA、抗-MPO、抗-PR3在原发性小血管炎中的临床应用价值[J].国际检验医志,2012,33(15)：1894-1896.

[6]蔡枫，谷丽华，夏莉婷.抗中性粒细胞胞浆抗体检测在自身免疫性疾病中的应用[J].放射免疫学杂志，2013，26(4)：464-466.

[7]陈维蓓，向瑜，张莉萍.两种方法联合检测自身免疫性疾病中ANCA的临床意义[J].国际检验医学杂志，2013，34(19)：2559-2561.

[8]周宇捷，相平，孙颖，等.血清总IgE鲁米诺氧通道免疫分析方法的建立[J].中华检验医学杂志，2013，36(11)：1033-1035.

[收稿2016-01-18修回2016-02-23]

(编辑张晓舟)

Comparison of chemiluminescent microparticle immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay for determination of anti-neutrophil cytoplasm antibodies

ZHANG Li-Juan.Department of Clinical Laboratory,Aviation General Hospital,Beijing 100012,China

Objective:To compare the performance of chemiluminescent microparticle immunoassay(CMIA) and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) for the determination of Anti-PR3 and Anti-MPO.Methods: Concentration of Anti-PR3 and Anti-MPO in serum samples from 166 patients with autoimmune diseases and 50 healthy donors were determined by using CMIA(Method A) and ELISA(Method B),respectively.The results from both assays were analyzed and compared by statistical methods.Results: Method A showed better intra-assay reproducibility and inter-assay reproducibility than Method B for the determination of high,medium and low levels of control serum.Both methods met the accuracy requirement.The correlation coefficient of Anti-PR3 and Anti-MPO were 0.987 8 and 0.989 6 for Method A and Method B,respectively.And the Kappa coefficients were 0.897 and 0.882 for Method A and Method B,respectively.Conclusion: The performance of Method A is superior to Method B for the deter-mination of Anti-PR3 and Anti-MPO,which makes Method A to be a potentially better choice for clinical application.

Anti-neutrophil cytoplasm antibodies(ANCA)；Myeloperoxidase(MPO)；proteinase 3(PR3)；Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay；Chemiluminescent Microparticle ImmunoAssay

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.020

R446.61文献标志码A

1000-484X(2016)08-1175-04

张立娟(1972年-)，女，副主任检验师，主要从事免疫学检验方面的研究，E-mail：immunitylab361@163.com。