ADAM33基因rs2280090，rs487377，rs2787094多态性与哮喘的相关性研究①

薛卫林　周兆山　王燕青　吉中强　张小燕　梁文华

(山东省青岛市海慈医疗集团肺病科，青岛266033)



ADAM33基因rs2280090，rs487377，rs2787094多态性与哮喘的相关性研究①

薛卫林周兆山王燕青吉中强②张小燕③梁文华④

(山东省青岛市海慈医疗集团肺病科，青岛266033)

①本文受国家自然科学基金资助项目(No.30873315)及山东省2015-2016年度中医药科技发展计划项目(No.2015-354)资助。

②山东省青岛市海慈医疗集团心内科，青岛266033。

③生物芯片国家工程研究中心，上海201203。

目的：探讨ADAM33基因多态性与青岛地区汉族成人哮喘的相关性。方法：采用SNaPshot方法检测研究对象ADAM33基因rs2280090、rs487377、rs2787094共3个位点的基因多态性。结果：rs2280090、rs487377和rs2787094基因型频率在哮喘组与对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论：ADAM33基因rs2280090、rs487377和rs2787094多态性与青岛地区汉族成人哮喘无相关关系。

哮喘；ADAM33基因；单核苷酸多态性；关联研究

支气管哮喘是一种复杂的多基因遗传病，到目前为止已发现在20余个染色体区域有数百个相关基因与哮喘的相关表型及发病风险有关，其中位于20号染色体的解整合素-金属蛋白酶33基因受到广泛关注，2002年Van Eerdewegh等[1]首次报道了ADAM33基因与气道高反应性和哮喘密切相关，近年来成为国内外学者研究的热点。结合文献我们选择ADAM33基因的rs2280090、rs487377、rs2787094共3个多态位点，探讨青岛地区成人中该基因多态性与哮喘的相关性，以期进一步揭示哮喘的遗传学发病机制。

1　对象与方法

1.1对象及分组共分2个组：哮喘组400例，对照组(正常人)200例，总共600例，年龄均在18～65岁之间，其中哮喘组男112例，女288例，平均年龄49.7岁，正常对照组200例，男74例，女126例，平均年龄39.5岁。哮喘组来自医院门诊和住院的哮喘患者，全部病例符合中华医学会呼吸病学分会哮喘学组2008年修订的《支气管哮喘防治指南》支气管哮喘诊断标准[2]，除外合并有心血管、肝、肾、内分泌或造血系统等严重原发性疾病及精神病患者。对照组来自健康查体人群，无哮喘病史、无家庭及个人过敏史。

1.2方法

1.2.1血标本采集与DNA制备抽取每名研究对象静脉血2 ml，注入EDTA抗凝管中，采用少量冻血快速酚-氯仿法抽提DNA，样品于-70℃保存备用。

1.2.2位点选择和引物设计通过3种方法选择ADAM33基因的多态位点：(1)文献中报道过的位点;(2)位于基因编码区且引起氨基酸改变的SNP，以及位于基因上游调控区的SNP;(3)搜索数据库中该基因上tagSNP，选出rs2280090、rs487377、rs2787094共3个位点，根据基因的目标序列和所选择的多态性位点，经在线Primer3 软件(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3.www.cgi)设计多重PCR引物序列，由上海复旦-天昊遗传分析平台负责引物合成。

1.2.3基因分析

1.2.3.1采用SNaPshot方法[3](1)扩增目的基因片段：将适量基因组DNA按一定顺序分别加至384孔板，再添加PCR扩增体系使反应物的终浓度如下：Taq聚合酶1 U，基因组DNA 5 ng，PCR引物各1 μmol，dNTP 0.3 mmol。PCR反应条件为：95℃2 min;94℃20 s,60℃ 40 s，72℃1.5 min共11个循环； 94℃ 20 s， 59℃ 30 s，72℃ 1.5 min共24个循环；72℃ 2 min。(2)PCR产物纯化：在10 μl PCR产物中加入1 U 虾碱酶(SAP)和1 U外切酶Ⅰ(Exonuclease Ⅰ)，37 ℃温浴60 min,然后75℃灭活15 min。(3)单碱基延伸：延伸反应体系(10 μl)包括5 μl SNaPshot Multiplex Kit,2 μl 纯化后多重PCR产物，1 μl 延伸引物混合物，2 μl 超纯水。PCR反应条件为：96℃ 1 min;96℃ 10 s，52℃ 5 s，60℃ 30 s共28个循环。(4)延伸产物纯化：在10 μl 延伸产物中加入1 U SAP酶，37℃温浴60 min，然后75℃灭活15 min。(5)脱盐、上机、基因分型：取延伸产物2 μl 用SAP酶纯化后在ABI3130xl测序仪上样，采用GeneMapper4.0对测序结果进行分析，获得基因分型报告。

1.2.3.2胶电泳及SNP分型峰形图(见图1～3)NG代表正常对照组，BG代表哮喘组，橙色峰为SIZE STANDARD,蓝色、绿色、红色、黑色峰分别代表延伸加入ddGTP、ddATP、ddTTP和ddCTP的延伸产物，峰下面标注的等位基因(如果用的延伸引物是正向的，则跟延伸加入的碱基一致，如果是反向的，则跟延伸加入的碱基互补)。其中横轴表示等位基因长度，即通过SNP反应延伸引物的长度来区分多重体系每个位点基因型的位置；纵轴表示每个延伸反应荧光信号的强度。

1.3统计学分析根据每个SNP位点的基因分布计算其基因型和等位基因频率，用精确检验确认其是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，哮喘组和对照组基因型频率的比较，其相对危险度以优势比(OR)及95%可信区间(95%CI)表示，运用逻辑回归法检验并校正性别和年龄的影响，计算OR和95%CI，遗传模型分别为Dominant(显性)、Recessive(隐性)和Log-additive(叠加作用)共3种，所有的统计检验均为双侧概率检验，P<0.05认为有统计学意义，统计软件为SPSS19.0。

图1　rs2280090Fig.1　rs2280090Note: A.Sample BG21,genotype TT;B.Sample NG92,genotype CC;C.Sample BG104,genotype CT.alC，alTs stand for allele.

图2　rs487377Fig.2　rs487377Note: A.Sample NG67,genotype AA;B.Sample BG114,genotype GG;C.Sample BG404,genotype GA.alA,alG stand for allele.

图3　rs2787094Fig.3　rs2787094Note: A.Sample BG141,genotype GG；B.Sample NG95,genotype CC；C.Sample NG78,genotype GC.alG,alC stand for allele.

2　结果

2.1引物设计结果针对ADAM33基因共3个SNP位点的DNA序列，设计各个位点的多重PCR特异性扩增引物和单碱基延伸引物，引物序列见表1。

2.2基因多态性分析

2.2.1哮喘组与对照组基因型和等位基因频率在校正性别和年龄的影响后，经精确检验，哮喘组与健康对照组其ADAM33基因3个SNP基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，表明其基因频率已达到遗传平衡。

2.2.2SNP单位点与哮喘的相关性分析运用逻辑回归法校正性别和年龄的影响后，计算基因型频率的OR和95%CI，结果显示，基因型频率在哮喘组与对照组间差异无统计学意义(P>0.05)，见表2～4。

表1　ADAM33基因3个SNPs的PCR特异性扩增引物和单碱基延伸引物Tab.1　Specific PCR amplification primer and single base extension primer for 3 SNPs of ADAM33

表2　rs2280090的基因型频率在对照组和哮喘组的分布Tab.2　Distribution of genotype frequency of rs2280090 in control group and asthma group

表3　rs487377的基因型频率在对照组和哮喘组的分布Tab.3　Distribution of genotype frequency of rs487377 in control group and asthma group

表4　rs2787094的基因型频率在对照组和哮喘组的分布Tab.4　Distribution of genotype frequency of rs2797094 in control group and asthma group

3　讨论

解整合素-金属蛋白酶33(A disintegrin and metalloprotease 33，ADAM 33)基因是2002年首个通过定位克隆发现的哮喘易感性基因，ADAM基因编码锌指依赖性金属蛋白酶，所有的ADAM家族成员都属于Ⅰ型跨膜蛋白[4]。最近克隆的人类ADAM33(hADAM33)基因[5]定位于20号染色体短臂(20p13)，跨度约14 kb，包含22个外显子和21个内含子，编码的蛋白质包含813个氨基酸，其结构类似于ADAM家族其他成员，由8个结构域组成。

自从ADAM33基因被确定为哮喘的易感基因后，探讨该基因在不同种族和不同地域中与哮喘的相关性成为国内外研究热点。

Howard等[6]的研究表明，对于四个种族人群[包括美国黑人、美国白人(除西班牙和丹麦籍外)、美国的西班牙籍人和丹麦籍白人]，ADAM33基因上8个SNPs(包括S1,S2,ST + 4,ST +7,T1,T2,V21和V4)在每一人群中至少有一种SNP与哮喘相关，但没有一种是四种人群共有的与哮喘相关的SNP。 Hirota等[7]采用PCR直接测序的方法鉴定了日本人群ADAM33基因上48个SNP，证实T1(Met764Thr),T2(Pro774Ser),S2和V-3与哮喘有关。Vergara等[8]的研究发现，哥伦比亚人群ADAM33基因ST+7与哮喘有相关性，H4(GCAGGG)与家系中的哮喘有关，V4、T2与血液中IgE水平相关。2011年Awasthi等[9]采用PCR-RELP方法对印度儿童ADAM33基因上的5个位点(F+1,S2,ST+4,ST+5和V4)进行多态性分析，发现S2,ST+5位点与哮喘危险性有关，而F+1、ST+4位点突变纯合子基因型和突变等位基因与哮喘危险性增加有关，单体型AGCCT、GGACT和AGCCC呈正相关，单体型ACAGT、AGCGC、AGCGT、GCAGC和GCCGT呈保护性相关。因此，认为ADAM33基因多态性与印度儿童哮喘相关。

国内Su等[10]对中国汉族人群 ADAM33基因V4、 T+1、T2、T1、S1、Q-1的多态性与哮喘的关系进行研究，发现V4、T+1和T1与汉族人群哮喘有关。此外，针对南方汉族人群，国内邱玉明等[11]研究发现ADAM33基因Met764Thr位点多态性与哮喘存在相关性，而另一项研究表明北方汉族该基因多态性与哮喘无相关[12]。因此，在不同人种中，ADAM33基因多态性的类型和频率、生物学功能及其与哮喘的关系，均可能有所差异。Ober等[13]认为人种不同，突变等位基因分布频率不同，与哮喘、过敏症的相关关系就可以不同；研究方法不同，入选病例标准不同，所得的结论也可不同。

我们的研究结果发现： ADAM33基因rs22800 90、rs487377和rs2787094的基因多态性与青岛地区汉族成人哮喘无相关关系。

[1]Van Eerdewegh P,Little RD,Dupuis J,etal.Association of the ADAM33 gene with asthma and bronchial hyperresponsiveness[J].Nature，2002,418:426-430.

[2]中华医学会呼吸病学分会.支气管哮喘防治指南[J].中华结核和呼吸杂志，2008，31(3)：177-185.

[3]梁文华，周兆山，吉中强，等.IL-4和IL-4R基因多态性与哮喘的相关性 [J].中医学遗传学杂志，2014，31(1)：97-100.

[4]Primakoff P,Myles DG.The ADAM gene family:surface proteins with adhesion and protease activity[J].Trends Genet,2000,16(2):83-87.

[5]Yoshinaka T,Nishii K,Yamada K,etal.Identification and characterization of novel mouse and human ADAM33s with potential metalloprotease activity[J].Gene,2002,28(1-2):227-236.

[6]Howard TD,Postma DS,Jongepier H,etal.Association of a disintegrin and metalloprotcase 33(ADAM33)gene with asthma in ethnically diverse populations [J].J Allcriry Clin Immunol,2003,112:717-722.

[7]Hirota T,Hasegawa K,Obara K,etal.Association between ADAM33 polymorphisms and adult asthma in the Japanese population [J].Clin Exp Allcriry,2006,36:884-891.

[8]Vergara CI,Acevedo N,Jimenez S,etal.A Six-SNP haplotype of ADAM33 is associated with asthma in a population of Cartagena,Colombia[J].Int Arch Allergy Immunol,2010,152:32-40.

[9]Awasthi S,Tripathi P,Ganesh S,etal.Association of ADAM33 gene polymorphisms with asthma in Indian children[J].J Hum Genet,2011，56:188-195.

[10]Su D,Zhang X,Sui H,etal.Association of ADAM33 gene polymorphisms with adult allergic asthma and rhinitis in a Chinese Han population[J].BMC Med Genet,2008,9:82.

[11]邱玉明，罗雅玲，赖文岩，等.ADAM33基因Met764Thr位点多态性与支气管哮喘发病及患者肺功能的相关性[J].中华结核和呼吸杂志，2007，30(7)：518-521.

[12]Wang P,Liu QJ,Li JS,etal.Lack of association between ADAM33 gene and asthma in a Chinese population[J].Int J Immunogene,2006,33(4):303-306.

[13]Ober C,Leavitt SA,Tsalenko A,etal.Variation in the interleukin 4-receptorαgene confers susceptibility to a asthma and atopy in ithnically diverse populations[J].Am J Hum Genet,2000,66:517-526.

[收稿2015-10-24修回2015-11-19]

(编辑张晓舟)

Association between ADAM33 polymorphisms and susceptibility of asthma

XUE Wei-Lin,ZHOU Zhao-Shan,WANG Yan-Qing,JI Zhong-Qiang,ZHANG Xiao-Yan，LIANG Wen-Hua.Department of Cardiology,Qingdao Hiser Medical Center,Qingdao 266033,China

Objective:To investigate the relationship between ADAM33 polymorphisms and susceptibility of asthma of Chinese in Qingdao.Methods: The polymorphism of ADAM33 gene,they were rs2280090，rs487377 and rs2787094,were detected with SnaPshot method.Results: There was no significant difference between asthma group and control group in genotypic frequencies.Conclusion: The study shows that the rs2280090，rs487377 and rs2787094 were not associated with susceptibility of asthma in Han nationality in Qingdao.

Asthma；ADAM33；Single nucleotide polymorphisms；Association analyses

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.003

R392文献标志码A

1000-484X(2016)08-1099-04

④，E-mail:at_mountain@163.com。

薛卫林(1964年-)，男，主任医师，主要从事哮喘临床研究，E-mail:drxw101@136.com。