淫羊藿和女贞子提取物对骨质疏松症大鼠性激素功能水平的影响①

李凝旭　涂　艳　沈　莹　覃艳琼　雷　超　柳湘洁

(华中科技大学同济医学院附属梨园医院老年病科，武汉430070)



·中医中药与免疫·

淫羊藿和女贞子提取物对骨质疏松症大鼠性激素功能水平的影响①

李凝旭涂艳沈莹覃艳琼雷超柳湘洁

(华中科技大学同济医学院附属梨园医院老年病科，武汉430070)

①本文为华中科技大学自主创新基金(2013QN127)。

目的：探讨淫羊藿和女贞子提取物对骨质疏松症(OP)大鼠性激素功能水平的影响。方法：50只3月龄雄性Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、提取物低剂量组、提取物中剂量组、提取物高剂量组共5组，每组10只，除正常组外，其他4组以维甲酸灌喂15 d制作OP模型，造模成功后正常组和模型组灌服生理盐水，提取物低剂量组、中剂量组和高剂量组分别按50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg灌服淫羊藿和女贞子提取物混合物，均持续3周。测量各组骨密度(BMD)，左侧股骨切片采用苏木精和伊红(HE)染色观察股骨病理学改变并测定骨小梁组织形态相关参数，免疫组织化学分析激素受体蛋白表达。结果：正常组股骨全部、股骨上端、股骨下端BMD显著高于模型组，提取物中剂量组和高剂量组股骨全部、股骨上端、股骨下端BMD显著高于模型组，提取物低剂量组股骨全部BMD显著高于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较，提取物各组骨小梁数量有了显著增加，完整性、连续性明显好转，相关参数比较结果显示，正常组Tb.N、Tb.Ar、Tb.Th显著大于模型组，Tb.Sp显著小于模型组，提取物中剂量组和高剂量组Tb.N、Tb.Ar、Tb.Th显著大于模型组，Tb.Sp显著小于模型组，提取物低剂量组，Tb、Ar、Tb、Th显著大于模型组，差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；正常组AR、ER蛋白表达量明显高于模型组，而提取物高剂量组AR、ER蛋白表达量较模型组显著上升，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论：淫羊藿和女贞子提取物能够增加维甲酸诱导的OP大鼠BMD，逆转骨组织病理结构，上调性激素受体蛋白表达，对维甲酸诱导的OP大鼠具有潜在的保护作用。

淫羊藿-女贞子；维甲酸；骨质疏松症；骨密度；性激素受体

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是一种临床常见的全身性、慢性骨骼疾病，以全身性骨量减少和骨组织显微结构破坏为特征，好发于绝经后女性和老年人[1]。由于OP患者骨的脆性增加，骨折的风险大大增加，特别是腕关节、髋关节和脊柱[2]。而随着人口老龄化的加剧，OP的发病率逐渐上升，其对老年人的健康和社会构成的威胁也日益严重，对OP的预防和治疗迫在眉睫。众所周知，骨骼是一种对雄激素和雌激素非常敏感的内分泌组织，而性激素在骨骼健康维护中扮演着重要的角色。雄激素和雌激素水平与骨代谢、骨密度(Bone mineral density，BMD)和骨质疏松性骨折密切相关[3]。已有研究证实，激素替代疗法(Hormone replacement therapy，HRT)可以有效预防绝经后妇女和中老年人OP和骨折的发生[4]，但是长时间服用会增加乳腺癌、冠心病、血栓栓塞和阴道出血发生风险[5]。出于对HRT副作用的担忧，人们开始将抗骨质疏松药的重心转移到了天然产物上。

中医认为“肾主骨”，骨骼健康与肾脏功能密切相关，而肾虚被认为是骨和关节疾病的根源[6]。淫羊藿和女贞子分别是中国古代医学中补充肾阳和肾阴的药物，长期用于增强骨骼功能和治疗OP。由于OP是一种慢性病症，需要长期服药，中医认为，补阳药性质温燥，不适合长期服用，如果能与补益肾精的药物配伍，以阴中求阳，能达到“阴阳相济之妙用”[7]。淫羊藿-女贞子是平补肾中阴阳之药对，其复方在OP的治疗中具有多年的历史，能够显著调节Ⅰ型胶原代谢水平，改善骨代谢。已有研究证实，淫羊藿-女贞子药对抗骨质疏松的效果主要依赖于淫羊藿总黄酮，女贞子环烯醚萜总苷和总黄酮[8，9]，但其具体的作用机制还有待深入探讨。

研究人员发现，维生素A过多症会引起骨吸收加快，骨骼脆弱和自发性骨折[10]，此外，膳食维生素A高摄入与BMD下降和髋部骨折的风险增加相关[11]，而维甲酸诱导的OP大鼠模型被认为是用于药物治疗OP观察药理作用和变化的标准模型，因此本研究决定采用维甲酸诱导的OP大鼠模型。毫无疑问，激素水平在骨丢失的改善中扮演了重要的角色，考虑到雌鼠血清雌二醇水平周期性变化，为了避免激素水平变化对研究结果的影响，本研究均选择雄性大鼠。

1　材料与方法

1.1淫羊藿、女贞子提取物的制备 分别取小檗科植物箭叶淫羊藿的干燥根茎和木犀科植物大叶女贞的成熟果实(均购自湖北省济民医药公司)制备提取物，具体为：用1 000 ml 90%浓度的乙醇提取淫羊藿，分别提取3、2、2 h(70℃下回流装置中)共3次，混合、过滤、浓缩至无酒精沉淀。石油醚萃取3次去除叶绿素，提取物用d-101大孔吸附树脂洗至无色，90%乙醇洗脱，蒸干得深黄色粉末，即淫羊藿总黄酮(Total flavonoids of Herba Epimedii，TFE)，提取率为2.5%，提取物中淫羊藿苷含量为80%。用1 000 ml 75%浓度的乙醇提取女贞子，分别提取3、2、2 h(70℃下回流装置中)共3次，混合、过滤、浓缩至无酒精沉淀。AB-8大孔树脂洗至无色，提取物蒸馏水洗净后75%乙醇洗脱，蒸干得女贞子环烯醚萜总苷和总黄酮(Total iridoid and flavonoids of fructus ligustri lucidi，TIFL)，提取率为5%，提取物中齐墩果酸和芦丁含量超过80%。淫羊藿与女贞子提取物混合以TFE∶TIFL为 2∶3的比例，用去离子水溶解混合物，分别得到5 mg/ml、10 mg/ml和20 mg/ml三种不同浓度的混合液。

1.2方法

1.2.1实验动物及分组 50只健康雄性Wistar大鼠，3月龄，体重220～250 g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心[生产许可证号：SCXK(颚)20010-0009]，常规条件饲养，适应性喂养1周，随机分为正常组(Normal)、模型组(Model)提取物低剂量组(Extracts-L)、提取物中剂量组(Extracts-M)、提取物高剂量组(Extracts-H)5组，每组10只，正常组按70 mg/(kg·d)蒸馏水灌胃15 d，其他4组均先造模，按70 mg/(kg·d)维甲酸灌喂15 d制作骨质疏松模型，当出现体毛枯疏、进食减少、口唇炎、反应迟钝、体重减轻、结膜充血等不良表征时视为造模成功，造模成功后正常组和模型组按1 mg/100 g灌服0.9%生理盐水，提取物低剂量组、中剂量组和高剂量组分别按50、100、200 mg/kg灌服TFE和TIFL提取物混合物，均持续3周。末次给药后后24 h麻醉大鼠，收集血液标本并用TGL-16B离心机(湖南星科科学仪器有限公司)分离获得血清，-80℃保存。迅速分离出左侧股骨，石蜡包埋，常规切片。

1.2.2BMD测量右侧股骨剔除软组织后置于生理盐水处理的无菌湿纱布中，采用美国GE公司生产的双能X线骨密度测定仪测定BMD，扫描位置包括股骨全部、股骨上端、股骨下端。扫描分辨率为1.0×1.0 mm，扫描速度是10 mm/s，重复测量3次计算平均值。

1.2.3股骨病理学改变及相关参数测定左侧股骨切片采用苏木精和伊红(Hematoxylin and eosin，HE)染色，BX53显微镜(日本奥林巴斯)下观察组织的结构变化情况，特别是骨小梁的结构和形态，采用显微镜自带的图像分析计算机系统分析骨小梁组织形态相关参数，包括骨小梁数量(Trabecular number，Tb.N)、骨小梁面积(Trabecular bone area，Tb.Ar)、骨小梁厚度(Trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁间距(Trabecular separation，Tb.Sp)。

1.2.4免疫组织化学分析激素受体蛋白表达鼠抗人雄激素受体(Androgen receptors，AR)抗体以及鼠抗人雌激素受体(Estrogen receptor，ER)均购自北京博奥森生物技术有限公司，切片脱蜡至水，灭活内源性过氧化物酶并修复抗原后蒸馏水冲洗2次，PBS浸泡5 min，滴加Ⅰ抗，PBS冲洗，3 min×3次，顺序滴加特异性生物素化第二抗体、过氧化物酶复合物，分别37℃温箱孵育30 min，PBS冲洗，3 min×3次，DAB显色、苏木素轻度复染，脱水、封片待检，B×53显微镜(日本奥林巴斯)下观察，每张切片取连续5个高倍视野观察染色细胞数，计算平均值。

2　结果

2.1各组BMD比较正常组股骨全部、股骨上端、股骨下端BMD显著高于模型组，差异具有统计学意义(P<0.01)；提取物中剂量组和高剂量组股骨全部、股骨上端、股骨下端BMD显著高于模型组，提取物低剂量组股骨全部BMD显著高于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见图1。

2.2各组骨组织病理学及相关参数比较HE染色结果见图2A，结果显示正常组大鼠骨松质部位骨小梁均匀丰富，呈红褐色，连续性好，呈网状致密结构，模型组骨小梁排列稀疏，数量明显减少，且部分断裂、不整齐，与模型组比较，提取物各组骨小梁数量有了显著增加，完整性、连续性明显好转，在提取物中剂量组和高剂量组表现的更明显；相关参数比较结果显示，正常组Tb.N、Tb.Ar、Tb.Th显著大于模型组，Tb.Sp显著小于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)，提取物中剂量组和高剂量组Tb.N、Tb.Ar、Tb.Th显著大于模型组，Tb.Sp显著小于模型组，提取物低剂量组，Tb.Ar、Tb.Th显著大于模型组，差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，见图2。

图1　各组股骨全部(A)、股骨上端(B)、股骨下端(C)BMD比较Fig.1　Comparison of BMD in whole of femur(A),femur head(B),and femur neck(C) among each groupNote: Compared with model group,*.P<0.05,**.P<0.01.

图2　各组骨组织病理学及相关参数比较Fig.2　Comparison of bone histomorphometry and trabecular bone parameters among each groupNote: Compared with model group,*.P<0.05,**.P<0.01;A.Representative microscope images of trabecular bone microarchitecture in femurs(×100);B.Comparison of Tb.Ar;C.Comparison of Tb.Th;D.Comparison of Tb.Sp;E.Comparison of Tb.N.

图3　各组性激素受体蛋白表达情况比较Fig.3　Comparison of protein expressions of AR and ER among each groupNote: Compared with model group,*.P<0.05,**.P<0.01;A.Expression levels of AR estimated by immunohistochemical analysis(×400);B.Expression levels of ER estimated by immunohistochemical analysis(×400);C.Quantitative analysis of protein expressions of AR and ER.

2.3各组性激素受体蛋白表达情况比较染色结果表明，股骨中AR、ER蛋白主要表达于细胞质中，染色呈淡棕色，定量分析表明，正常组AR、ER蛋白表达量明显高于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)，而提取物高剂量组AR、ER蛋白表达量较模型组显著上升，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

3　讨论

OP 属于中医“骨痹”“骨痿”范畴，中医认为肾主骨，肾精充实则骨得其养，骨髓生化有源、坚固；肾精亏虚则骨失其养，骨髓化生乏源、骨骼脆弱。因此，OP的病机为肾虚精亏，治则为从肾论治[6]。淫羊藿和女贞子是临床治疗OP常用的中药组方，其中淫羊藿坚筋骨、温肾壮阳，女贞子滋补肝肾阴精，加上OP病程较长，需要长期坚持服药，而单纯补阳药淫羊藿性质温燥，不宜长期服用，而两药配伍能平补肾中阴阳，发挥阴阳相济的效果[7]，因此本实验设计时将两种药配伍使用，而未设置单用药物的分组。中草药发挥药效主要依赖于其活性成分，因此本研究选择淫羊藿总黄酮、女贞子环烯醚萜总苷和总黄酮作为两种中草药的活性成分，研究其抗骨质疏松的效果。

本研究采用BMD和股骨病理学改变及相关参数来评价淫羊藿、女贞子提取物对维甲酸诱导的OP大鼠模型药效。BMD是反映骨质量和骨强度指标[12]，本研究结果发现，正常组股骨全部、股骨上端、股骨下端BMD显著高于模型组，差异具有统计学意义。模型组BMD下降的原因可能是由于骨代谢增加，骨吸收量大于形成量。提取物中剂量组和高剂量组股骨全部、股骨上端、股骨下端BMD显著高于模型组，提取物低剂量组股骨全部BMD显著高于模型组，差异均有统计学意义。虽然BMD是骨强度的一个重要决定性因素，但它并不能反映骨小梁表面的重建[13]，因此本研究还观察了股骨病理学改变及相关参数来评价骨量丢失和骨骼结构的恶化程度。结果显示，模型组骨小梁排列稀疏，数量明显减少，且部分断裂、不整齐，Tb.N、Tb.Ar、Tb.Th显著减小，Tb.Sp显著增大，提取物各组骨小梁数量有了显著增加，完整性、连续性明显好转，Tb.Ar、Tb.Th显著增大，Tb.Sp显著减小，在提取物中剂量组和高剂量组表现的更明显。本研究结果表明，淫羊藿和女贞子提取物可以减少维甲酸诱导的OP大鼠骨质流失，增强骨骼强度。

性激素减少是OP发生的重要原因之一，无论是男性OP患者或者绝经后妇女，雄性激素的减少与骨质流失密切相关[14]。血清睾酮(Testosterone，T)下降引起的骨密度和骨质量下降是男性OP发生的重要原因。下丘脑-垂体-性腺轴功能障碍会引起激素分泌障碍，从而引发OP。性激素只有与受体结合才能调节骨重塑，激素受体AR、ER是依赖配体活化转录因子的核受体家族成员，能够作用于靶基因受体反应元件，诱导基因转录，参与细胞的增殖和分化。细胞环境、与之结合的配体、募集的辅助调节因子等多种因子参与了调节激素受体功能，其生物效应与多种疾病的发生、预后相关[15,16]。本研究结果发现，正常组AR、ER蛋白表达量明显高于模型组，差异有统计学意义，表明维甲酸诱导的OP大鼠会引起AR、ER蛋白表达下降。而提取物高剂量组AR、ER蛋白表达量较模型组显著上升，差异有统计学意义，这表明，淫羊藿和女贞子提取物可以扭转维甲酸诱导的这种效应，上调AR、ER蛋白的表达，改善性激素功能。

总而言之，淫羊藿和女贞子提取物能够增加维甲酸诱导的OP大鼠BMD，逆转骨组织病理结构，上调性激素受体蛋白表达，对维甲酸诱导的OP大鼠具有潜在的保护作用，有望成为OP预防和治疗的新选择。然而，其通过影响骨代谢发挥抗骨质疏松作用的具体作用机制还有待进一步研究。

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[收稿2015-12-21修回2016-01-16]

(编辑许四平)

Effect on sex hormone functional of extracts of Herba Epimedii/Fructus Ligustri Lucidi in osteoporosis rats

LI Ning-Xu,TU Yan,SHEN Ying,QIN Yan-Qiong,LEI Chao,LIU Xiang-Jie.Department of Geriatrics,Liyuan Hospital,Tongji Medical Colloge,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430070,China

Objective:To explore the effect on sex hormone functional of extracts of Herba Epimedii/Fructus Ligustri Lucidi in osteoporosis rats.Methods: 50 cases of 3 months Wistar rats were rando mly divided into normal group,model group,extract low dose group(extract-L),extract middle dose group(extract-M),extract high dose group(extract-H),10 cases in each group,in addition to the normal group,other 4 groups were bulided OP model by filling and feeding retinoic acid for 15 d,then normal group and model group were filling physiological saline;extract-L,extract-M,extract-H were respectively feeding extracts of Herba Epimedii/Fructus Ligustri Lucidi at 50 mg/kg,100 mg/kg,200 mg/kg,both for 3 weeks.Measured the bone mineral density(BMD),observed the femoral pathology change of left femur with hematoxylin and eosin(HE) staining,measured trabecular bone tissue morphology related parameters,analyzed the hormone receptor protein expression with immunohistochemistry.Results: The BMD of the whole femur,femur head,and femur neck in normal group were all significantly higher than that of model group,the BMD of the whole femur,femur head,and femur neck in extract-M and extract-H group were all significantly higher than that of model group,the BMD of the whole femur in extract-L group was significantly higher than that of model group,the differences were statistically significant(P<0.05 orP<0.01).The bone trabecular number had significantly increased,integrity,continuity improved significantly,bone histomorphometry such as Tb.Ar,Tb.Th,and Tb.N in model group were decreased,and Tb.Sp was increased,extract-M and extract-H group had remarkable effect on each index,while extract-L group only had a remarkable effect on Tb.Ar and Tb.Th(P<0.05 orP<0.01),compared with model group.The expression of AR,ER in normal groups were significantly higher than that of model group,the expression of AR,ER in extract-H group was significantly higher than that of model group,the differences were statistically significant(P<0.05 orP<0.01).Conclusion: This study demonstrated that the combination with TFE and TIFL had potential protective effects on osteoporosis rats induced by retinoic acid.The combination with TFE and TIFL is able to increase BMD,reverse pathological changes of bone tissue,coordinate hormones of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis,and upregulate the expression of sex hormone receptors.

Herba epimedii/fructus ligustri lucidi;Retinoic acid;Osteoporosis;Bone mineral density;Sex hormone receptors

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.013

R285.5文献标志码A

1000-484X(2016)08-1145-05

李凝旭(1977年-)，女，博士，主治医师，主要从事老年医学、内分泌学、骨质疏松症等方面的研究，E-mail：liningxu33@163.com。

及指导教师：柳湘洁(1968年-)，女，主任医师，主要从事老年医学、内分泌学方面的研究，E-mail：liuxiangjie89@163.com。