通降和胃方对胃食管反流性咳嗽豚鼠呼吸道组织学形态的影响*

刘春芳　曹会杰　程艳梅　王宏伟　张秀莲　朱生樑△（.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 00437；.上海中医药大学附属普陀区中心医院，上海 0000）



通降和胃方对胃食管反流性咳嗽豚鼠呼吸道组织学形态的影响*

刘春芳1曹会杰2程艳梅1王宏伟1张秀莲1朱生樑1△
（1.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437；2.上海中医药大学附属普陀区中心医院，上海 200002）

目的 观察通降和胃方对胃食管反流性咳嗽豚鼠模型呼吸道组织学形态的影响。方法 健康雄性豚鼠40只，随机分为中药组、西药组、模型组和正常组。除正常组外，其余各组采用食管下端酸灌注法制作胃食管反流性咳嗽模型，并分别予相应药物混悬液及等量生理盐水处理，光镜下观察气管、肺病理组织学改变，透射电子显微镜下观察肺组织超微结构。结果 模型组气管、肺组织炎症积分较正常组明显升高（P＜0.05），中药组、西药组与模型组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；中药组气管、肺组织炎症积分低于西药组，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 通降和胃方能够有效抑制反流，降低气道神经源性炎症的发生，改善呼吸道炎症反应，达到治疗胃食管反流性咳嗽的目的。

胃食管反流性咳嗽食管气道神经源性炎症疏肝和胃方从胃治咳

【Abstract】Objective：To observe the effect of Tongjiang Hewei Decoction on histopathological characteristics of the airway in guinea pigs with gastroesophageal reflux induced cough.Methods：Forty healthy male guinea pigs were randomly divided into 4 groups：Tongjiang Hewei group，the control group，the model group and the normal group.GERC models were induced repeatedly by hydrochloric acid instillation with the corresponding intervention measures to each group，except the normal group.After two weeks，all animals were executed and the histological changes of the trachea and lung tissue were observed.Evans Blue-invasive method was used to determine pulmonary capillary permeability in guinea pigs.Ultrastructural changes of lung tissues were observed under transmission electron microscope.Results：The inflammation of the trachea and lung tissue in the model group was much more obviously than that of the normal group（P＜0.05）.There was a significant difference in improving the guinea pig trachea and lung tissue pathologic scores in Tongjiang Hewei group and the control group，compared with the model group.Comparing Tongjiang Hewei Decoction with omeprazole，there was a significant difference in improving the two scores（P＜0.05）.Conclusions：Tongjiang Hewei Decoction can effectively inhibit acid reflux，reduce airway neurogenic inflammation，thereby reduce the inflammatory exudate and cure cough.

【Key words】Gastroeso phageal reflux induced cough；Airway neurogenic inflammation；Tongjiang Hewei Decoction；Cure cough from stomach

胃食管反流性咳嗽（GERC）是以慢性咳嗽为主要临床表现的胃食管反流病，属于胃食反流病的一种特殊类型，目前临床上认为慢性咳嗽、慢性喉炎及哮喘与胃食管反流病显著相关［1］，慢性咳嗽反复发作，往往造成患者生活质量的显著下降。通降和胃方是上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院胃食管反流病专科负责人朱生樑教授依据《内经》“此皆聚于胃，关于肺”的论述，基于对本病病因病机的认识，以“从胃治咳”的思路出发创制而成，临床应用多年，效果显著［2］。本文观察了通降和胃方对GERC豚鼠模型呼吸道组织学形态的影响，以探讨其治疗GERC的作用机制。

1　材料与方法

1.1实验动物普通级雄性豚鼠共40只，2～3月龄，体质量（300±50）g，由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院实验动物中心提供，上海市斯莱实验动物有限责任公司生产 ［动物合格证号SCXK（沪）2012-0002］。给予室内温度（20±2）℃，湿度（50±10）%，标准饲料饲养。

1.2实验药物通降和胃方：旋覆梗12 g，代赭石15 g，柴胡9 g，枳壳12 g，焦山栀9 g，川楝子9 g，黄连3 g，吴茱萸3 g，太子参12 g，生姜4.5 g，甘草6 g。以上药物均采用中药颗粒剂（由本院药剂科提供），使用前配成溶液。奥美拉唑胶囊20 mg（常州四药制药厂，生产批号20140602），使用前配成溶液。

1.3试剂与仪器胃蛋白酶（批号P7000）购自Sigma公司；戊巴比妥钠 （批号18569802）、浓盐酸 （批号80070590）购自国药集团化学试剂有限公司；0.5%伊红、苏木素、二甲苯、梯度酒精由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院病理室提供；2%戊二醛、磷酸缓冲液、锇酸固定液等由上海中医药大学科技实验中心提供。组织脱水机（日本樱花精机株式会社VIPE300F）、樱花包埋机（日本樱花精机株式会社4715）、切片机（德国MEDIS公司13/30RR型）、切片漂烘温控仪 （安徽电子科学研究所QP-B）、OLYMPUS显微镜（BX51）、电子扫描镜（荷兰PHILIPS TECHAI-12）

1.4分组及造模将40只豚鼠采用随机数字表法随机分为正常组、模型组、中药组和西药组，每组10只。除正常组外，其余3组均参照文献［3］报道，采用盐酸灌注法制备GERC动物模型。

1.5给药方法根据豚鼠和人体间等效剂量换算的折算倍数是5.5倍［4］，中药组给予颗粒剂生药量为0.866 g/100 g，西药组给予奥美拉唑0.367 mg/100 g，每日灌胃两次，每次1 mL/100 g体质量，连续灌胃14 d。正常组不给药，模型组灌胃等量生理盐水。

1.6标本采集与检测

1.6.1气管、肺组织光镜病理切片的制备2周后，腹腔过量注射2%戊巴比妥钠处死豚鼠，取出气管近喉部0.5 cm组织、肺组织1 cm×1 cm，置10%甲醛溶液中固定，脱水，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色，树脂封片。光镜下观察气管、肺组织的形态学表现。气管炎症病理积分参照何权灜等［5］制定的小气道八项病理指标判分标准，依据血管和气管周围嗜酸性细胞、上皮损伤、水肿严重程度进行肺组织炎症积分评定［6］。

1.6.2肺组织电镜病理切片的制备在低温下迅速取下肺组织0.5 cm×0.5 cm，保持低温环境下2%戊二醛固定液固定2 h以上，0.1 mol/L磷酸缓冲液充分洗涤；1%锇酸后固定2 h，磷酸缓冲液清洗0.5 h；梯度酒精脱水；环氧树脂渗透包埋；超薄切片制作（80 nm）；透射电子显微镜下观察肺组织微血管内皮细胞形态、基底膜形态、毛细血管壁电子密度等。

1.7统计学处理应用SPSS19.0统计软件统计。符合正态分布以（±s）表示。符合正态分布采用方差分析进行比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1一般情况造模后7 d观察，除正常组外，余3组实验动物均有不同程度的饮食减少，体质量减轻。造模第11天后观察，除正常组外，余3组实验动物均有不同程度的喷嚏、呛咳表现，少数动物有呼吸急促、喘息，甚则腹肌收缩、难于行走，甚至死亡。最终因麻醉意外死亡2只，因肺部严重感染死亡2只。剩余36只实验豚鼠，各组体质量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2各组豚鼠气管组织病理改变见图1，表1。HE染色显示正常组豚鼠气管组织结构基本正常；模型组气管组织可见纤毛柱状上皮明显增生，黏膜及黏膜下层充血、肿胀，炎性细胞浸润；中药组及西药组气管组织可见不同程度的上皮增生，炎性细胞浸润较模型组减少。与正常组比较，模型组气管炎症积分明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；中药组、西药组与模型组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；中药组气管炎症积分低于西药组，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1　各组豚鼠气管组织病理学改变（HE染色，200倍）

表1　各组豚鼠气管、肺组织病理积分比较（分，±s）

表1　各组豚鼠气管、肺组织病理积分比较（分，±s）

与模型组比较，*P＜0.05；与西药组比较，△P＜0.05。

组　别　n　气管炎症积分　肺组织炎症积正常组　10　3.90±2.02*　5.00±0.52*模型组　8　6.50±0.36　13.38±1.41中药组　9　3.44±1.81*△　7.77±2.86*△西药组　9　4.96±0.71*　11.63±2.13

2.3各组豚鼠肺组织病理改变见图2，表1。HE染色显示正常组豚鼠肺组织结构无明显损伤，肺泡结构完整，有少量炎性细胞浸润。模型组肺组织肺泡结构破坏严重，见广泛的弥漫性的充血水肿，肺泡萎缩、间隔增宽，肺实变，肺内见大量中性粒细胞浸润。中药组及西药组肺泡结构见不同程度的破坏，肺间质水肿及炎性细胞浸润，但较模型组轻微。模型组肺组织炎症积分明显高于正常组 （P＜0.05），西药组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），中药组与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），中药组肺组织炎症积分明显低于西药组（P＜0.05）。

图2　各组豚鼠肺组织病理学改变（HE染色，200倍）

2.4各组豚鼠肺组织电镜下观察见图3。正常组豚鼠微血管内皮细胞及基底膜形态结构基本正常：层次清晰分明，内皮细胞无水肿充血，基底膜连续完整，未见明显损坏。模型组内皮细胞损伤广泛，可见毛细血管内皮充血、肿胀或增厚，细胞内吞饮小体增多；基底膜缺损、疏松、不规则；毛细血管-肺泡膜受损，内皮细胞及基膜之间水肿，个别标本肺泡腔内可见淋巴细胞。西药组可见微血管内皮细胞肿胀、充血，毛细血管壁电子密度降低；基底膜欠清晰、不完整，甚则可见基底膜纤维化；内皮细胞内吞饮小体增多；毛细血管-肺泡膜受损，内皮细胞及基膜之间水肿。中药组微血管内皮细胞略肿胀，但基底膜连续完整，层次尚清晰，毛细血管-肺泡膜未见明显受损，毛细血管壁电子密度未见明显降低，

图3　各组豚鼠肺组织超微结构变化（TEM，11500倍）

3　讨　论

GERC当属中医学“内伤咳嗽”范畴，中医学为咳嗽的论述奠定了深厚的理论基础，如《内经》云“五脏六腑皆令人咳，非独肺也”“此皆聚于胃，关于肺”等均为肺胃相关理论提供了坚实的依据。肺与胃位置相近，经络相连，肺属金，胃属土，二者可谓为子母之脏腑，生理上相互依赖，相辅相成。任何致病因素引起胃失和降都可影响肺之肃降，导致肺气上逆而发为咳。由胃而咳，势必先影响中焦之气机，而中焦气机又与肝密切相关，因此GERC主要涉及肺、胃、肝。GERC病理基础在于气机升降失调，基本病机为肝失疏泄，胃失和降，肺失肃降。鉴于以上认识，朱生樑教授以“从胃治咳”为治疗思路，以疏肝泄热，和胃降逆为具体治则，并结合多年临证用药经验，总结出了治疗GERC验方——通降和胃方。方中诸药合用，降胃为主，辅以疏肝健脾。胃气得降，自不能上犯华盖而壅塞肺络；肝热得清，便不得上灼肺金而肺失清肃。胃气通降，肺气清肃，胃和而咳止。前期研究显示该方可明显提高食管下括约肌环形肌张力［7］，减少胃内容物反流，同时还可调节胃电节律，促进胃排空［8-9］，从而发挥其多层次、多靶点的治疗作用。

食管-气道神经源性炎症是GERC发病的主要机制之一［10］。气管与食管共同起源于胚胎时期的前肠，两者具有共同的神经通路，都由迷走神经支配。调节咳嗽的重要通路是分布于气道和肺内的迷走感觉神经，但调节咳嗽反射的另一组重要的迷走传入通路是分布于食管的感觉神经［11］。食管内感觉神经受刺激可以直接导致咳嗽或经由中枢神经导致咳嗽兴奋性升高［12］。当反流入食管的胃内容物（胃酸、胃蛋白酶等）刺激食管下段黏膜酸敏感辣椒素受体，沿迷走传入神经传至延髓迷走孤束核和迷走运动背核，引起中枢神经递质释放，沿迷走传出神经传出至气道，引起气道感觉神经肽SP、NKA、NKB和CGRP等表达和释放增加，在气道内发挥其生物活性，导致支气管收缩，气道血管通透性增高，血浆渗出增加，从而产生气道神经源性炎症，引发GERC［13-14］。

食管下段酸灌注法是目前国内外公认的制备GERC动物模型的方法［15］，该模型证明了食管-气道神经源性炎症的存在。本次实验通过复制GERC动物模型，观察到在模拟胃酸、胃蛋白酶的作用下，反流液对豚鼠气道的损伤主要表现在纤毛柱状上皮的增生及炎性细胞的浸润，肺组织的损伤主要表现在毛细血管-肺泡膜损伤，肺泡结构破坏及炎性细胞浸润。同时通降和胃方组肺组织间质水肿及炎性细胞浸润较模型组明显轻微，且毛细血管-肺泡膜未见明显受损。这提示通降和胃方能够减少反流物对食管下端的反复刺激，降低气道神经源性炎症的发生，从而发挥治疗GERC的作用。

［1］ 胃食管反流病的蒙特利尔（Montrea1）和分类——基于循证医学的全球共识［J］.中华消化杂志，2006，26（10）：686-689.

［2］ 朱生樑，马淑颖，李海燕.通降和胃方治疗胃食管反流病合并夜间呛咳38例临床观察［J］.上海中医药杂志，2007，41 （8）：31-32.

［3］ 刘春丽，赖方，陈如冲，等.盐酸灌注豚鼠食管反流性疾病模型的建立［J］.中国病理生理杂志，2006，22（3）：620-621.

［4］ 黄继汉，黄晓晖，陈志扬，等.药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算［M］.中国临床药理学与治疗学，2004，9（9）：1069-1072.

［5］ 何权灜，穆魁津，李吉友，等.小气道功能异常与病理变化之间关系的初步探讨［J］.中华结核与呼吸系统疾病杂志，1985，8（4）：233-237.

［6］ Underwood S，Foster M，Raebum D，et al.Time-course of antigen-induced airway inflammation in the guinea-pig and its relationship to airway hyperresponsiveness［J］.Eur Respir J，1995，8（12）：2104-2113.

［7］ 朱生樑，马淑颖，王宏伟，等.丁香降气方对混合反流性食管炎家兔下食管括约肌钙通道调控机制研究［J］.中医杂志，2009，50：237-240.

［8］ 孙永顺，尚莹莹，朱生樑.丁香降气方对反流性食管炎大鼠胃排空及 Cajal间质细胞影响的实验研究［J］.新中医，2012，44（10）：130-133.

［9］ 程艳梅，刘春芳，曹会杰，等.丁香降气方对反流性食管炎大鼠IL-8及其受体的影响［J］.上海中医药杂志，2012，46 （8）：77-80.

［10］Yang X，Jiang M.Advances in studies on mechanism of gastroesophageal reflux-in duced cough［J］.Zhonghua Er Ke Za Zhi，2014，52（2）：156-160.

［11］Canning BJ.Encoding of the cough reflex［J］.Pulm Pharmacol Therap，2007，20：396-401.

［12］Canning BJ，Mazzone SB.Reflex mechanisms in gastroesophageal reflux disease and asthma［J］.Am J Med，2003，115：45S-48S.

［13］Xu X，Yang Z，Chen Q，et al.Comparison of clinical characteristics of chronic coughdue to non-acid and acid gastroesophageal reflux［J］.Clin RespirJ，2015，9（2）：196-202.

［14］Cheng YM，Cao AL，Zheng JP，et al.Airway hyperresponsiveness induced by repeated esophageal infusion of HCl in guinea pigs［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2014，51（5）：701-708.

［15］姚卫民，赖方，刘春丽.多次食管酸灌注对哮喘豚鼠气管神经肽含量的影响［J］.广东医学，2009，30（8）：1066-1068.

（收谢日期2015-11-09）

Effect of Tongjiang Hewei Decoction on Histopathological Characteristics of the Airway in Guinea Pigs with Gastroesophageal Reflux Induced Cough

LIU Chunfang，CAO Huijie，CHENG Yanmei，et al.Yueyang Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200437，China.

R285.5

A

1004-745X（2016）05-0788-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.05.011

国家中医药管理局“十二五”重点专科项目（09JIX1L206B118）；上海市科委科技支撑项目（13401902800）
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