基于TGF-β-MAPK信号通路探讨狼疮定对SLE的治疗作用*

徐晨婷　李海昌　谢志军　温成平（浙江中医药大学，杭州 浙江 310053）



基于TGF-β-MAPK信号通路探讨狼疮定对SLE的治疗作用*

徐晨婷李海昌谢志军温成平△
（浙江中医药大学，杭州 浙江 310053）

目的 观察狼疮定对MRL/lpr狼疮模型鼠的转化生长因子β（TGF-β）-MAPK信号通路上的蛋白含量变化的影响。探讨狼疮定治疗SLE的内在机制，为治疗SLE提供理论依据。方法 制备MRL/lpr狼疮模型鼠，取小鼠脾脏组织，提取其淋巴细胞总蛋白，再对提取总蛋白行浓度测试，然后根据蛋白浓度上样，进行蛋白免疫印迹实验，蛋白表达情况，进行结果分析。结果 Western blot法对小鼠各组脾脏淋巴细胞TGF-β2蛋白进行电泳实验结果示，正常组TGF-β2表达极少，而模型组表达明显升高，而中药组表达明显下降。正常组小鼠脾脏淋巴细胞JNK表达含量很少，而中药组表达很高，但中药组表达比模型组明显下降。正常组Erk表达很高，狼疮小鼠模型组表达下降，中药组用药后，Erk表达仍较少，与模型组区别度不明显。结论 以TGF-β-MAPK信号通路为基础，根据蛋白免疫印迹法实验发现，狼疮定影响MRL/lpr狼疮模型鼠脾脏淋巴细胞总蛋白的表达，可能是狼疮定治疗SLE的机制。

TGF-β-MAPK信号通路MRL/lprWestern blot

【Abstract】Objective：To observe the effect of Langchuangding on the change of protein content in TGF-β-MAPK signaling pathway of a given MRL/lpr mouse with lupus，and investigate the inherent mechanism of treatment on SLE to provide a theoretical basis.Methods：MRL/LPR mice model with Lupus was fed and given medicine.Spleen tissues were taken and the lymphocyte of total protein was extracted，and then the extraction of total protein concentration was tested.According to the protein concentration of the sample，protein immunoblot experiments，protein expression were analyzed.Results：According to the protein immunoblot experiment，Langchuangding Decoction had a certain influence on protein expression of spleen lymphocytes in MRL/Lpr mice with lupus.Conclusion：On the basis of TGF-beta-MAPK signaling pathways，according to the protein immunoblot experiment，Langchuangding Decoction has a certain influence on protein expression of spleen lymphocytes in MRL/Lpr mice with lupus.Therefore，Langchuangding Decoction has an influence on MRL/Lpr mice with lupus，which suggests that Langchuangding Decoction has an effect on SLE.

【Key words】TGF-β-MAPK signaling pathway；MRL/lpr；Western blot

系统性红斑狼疮（SLE）是累及全身多个系统的自身免疫疾病，主要表现为发热、皮疹、关节炎、肾炎、溶血性贫血、血小板减少及中枢神经系统损害等［1］。以年轻女性多见，临床表现为面部蝶形红斑，多脏器受累，疾病反复发作。它与其他自身免疫疾病一样，免疫系统攻击自身细胞和组织，对皮肤黏膜，关节，肾脏，心脏，脑，神经等都有不同程度的损害［2］，对人类的危害极大。

SLE目前无法治愈，西医没有较好的治疗方法，一般采用激素或免疫抑制剂治疗，但其副作用大，如长期服用激素会造成高血压、消化道溃疡出血、内分泌紊乱、骨质疏松，免疫抑制剂会导致骨髓抑制，肝功能损害［3-6］，同时治疗效果也不突出。因此，研究人员开始研究中药汤剂对SLE的治疗影响。中医认为，SLE与肝肾阴虚、外感热毒、内生毒邪及血瘀内阻的病机关系密切，范永升教授提出解毒祛瘀滋阴法是SLE的基本治法［7］，并提炼出基本方狼疮定。中医治疗SLE，对患者副作用小，同时对西药副作用具有调理作用。本实验观察狼疮定对 MRL/lpr狼疮鼠的转化生长因子 β （TGF-β）-MAPK信号通路上的蛋白含量变化的影响，探讨狼疮定治疗SLE的内在机制，为治疗SLE提供理论依据。现报告如下。

1　材料与方法

1.1动物实验动物由浙江中医药大学动物实验中心提供，SPF级8周龄C57BL/6J雌性小鼠10只，体质量（21.8±2.1）g，SPF级8周龄MRL/lpr雌性小鼠20只，体质量（30.5±2.1）g，生产许可证号：SCXK（沪）2012-002。

1.2药物青蒿12 g，炙鳖甲12 g，升麻9 g，白花蛇舌草15 g，积雪草15 g，干地黄15 g，赤芍12 g，炒薏苡仁15 g，佛手片9 g，生甘草6 g。由浙江中医药大学制成浓缩液，浓煎为80 mL（质量浓度1.5 g生药/mL）。

1.3主要仪器电热恒温水浴锅 （型号：DK-S12，上海森信实验仪器有限公司）；垂直板电泳装置 （型号：R179，BIO-RAD American），转膜装置 （BIO-RAD American），电泳仪（型号：042BR08121，BIO-RAD American）；微量移液器（Eppendorf，Germany）；台式高速冷冻离心机 （型号：5407XKO26772，Eppendorf Germany）；电热恒温鼓风干燥箱（型号：DGG-9123，上海森信实验仪器有限公司）；BIO-RAD凝胶图像分析系统（型号：720BR101492，BIO-RAD American）。

1.4主要试剂上样缓冲液（4×）：2 mL Tris-HCl （0.5 M，pH 6.8），3.2 mL SDS，0.8 mL β-巯基乙醇，1.6 mL甘油，0.4mL溴酚蓝。10%SDS：称取10 g SDS，加ddH2O定容至100 mL。电泳缓冲液（10×）：30.25 g Tris+ 144.1 g甘氨酸+2 g SDS用 ddH2O定容至1000 mL 4℃保存。转移缓冲液（1×）：先配转移缓冲液（4×）：12 g Tris+57.6 g甘氨酸+4 g SDS，定容至800 mL，使用时取200 mL转移缓冲液 （4×）+600 mL ddH2O+200 mL甲醇，定容至1000 mL。TBS（10×）：750 mL ddH2O，12.12 g Tris，88 g NaCl，调pH8.0，定容至1000 mL。TBST（1×）：50 mL TBS（10×）+0.5 mL Tween-20，ddH2O定容至500 mL。封闭液：5 g脱脂奶粉，溶于100 mL 1×TBST缓冲液，溶解后4℃保存。

1.5动物分组及给药正常组10只C57BL/6J小鼠；模型组10只MRL/lpr小鼠；中药组10只MRL/lpr小鼠。适应性喂养1周后开始灌胃给药。正常组和模型组：灌胃生理盐水，每日1次；中药组：灌胃狼疮定浓缩液，灌胃量为每10 g体质量1mL（给药剂量为15 g生药/kg，为临床剂量的7.5倍），每日1次；连续饲养用药8周后处死。

表1　96孔板试剂加样量

1.6观察指标1）脾脏淋巴细胞总蛋白。取MRL/lpr狼疮鼠脾脏，加入红细胞裂解液，用玻璃匀浆器充分研磨，将研磨液于离心管中，10000～14000 g离心5 min，取上清，上清即为淋巴细胞总蛋白。2）总蛋白浓度检测。（1）检测步骤：取1.2 mL蛋白标准配置液加入到一管蛋白标准中，充分溶解后配置成25 mg/mL的蛋白标准溶液；取适量25 mg/mL蛋白标准，稀释至终质量浓度为0.5 mg/mL蛋白标准，加入980 μL稀释液即可配置成0.5 mg/mL蛋白标准。根据样品数量，按体积比50∶1取BCA试剂A、BCA试剂B配置适量BCA工作液，充分混合（BCA工作液室温24 h内稳定）。将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20 μL加到96孔板的标准品中，加标准品稀释液补足到20 μL；加适当体积样品，一般为1 μL，到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20 μL；各孔加入200 μL BCA工作液，37℃放置20～30 min。（2）标准曲线的制作：见表1。上述试剂加完后，准确吸取20 μL样品溶液于96孔板中，加入BCA试剂200 μL，轻摇，于37℃保温30～60 min，冷却至室温后，以空白为对照，在多功能酶标仪上590 nm处比色，以牛血清白蛋白含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线空白为对照，根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量。3）蛋白免疫印迹法。（1）SDS-PAGE：检漏；按表2、3配胶；样品与样品处理液（2×）1∶1混匀，于100℃沸水浴煮沸3～5 min，使蛋白质变性，与SDS-蛋白质复合物带上大量负电荷，消除样品电荷的影响；上样量为15～20 μL，用微量进样器加样；样品在浓缩胶时为60 V，到达分离胶后调至80 V，当条带跑至分离胶底部1 cm处，停止电泳。（2）转膜准备：电泳结束前30 min，将海绵、滤纸12张、NC膜浸泡到转移缓冲液中；将凝胶置于转移缓冲液中漂洗，以洗去SDS，使蛋白变性。（3）转膜（-）海绵+4层滤纸+凝胶+NC膜+4层滤纸+海绵（+）：凝胶与NC膜之间不留气泡，NC膜一旦与凝胶接触覆盖，则不可移动，NC膜靠正板；80 V，2 h，时间长短根据需转移的蛋白相对分子质量大小而定，相对分子质量大时间长，相对分子质量小时间短，在转移的过程中，将电泳槽置于冰水中。（4）封闭：5%脱脂奶粉室温封闭2 h，使NC膜上多余的蛋白结合位点完全与之结合。（5）免疫检测：一抗孵育：加入一抗溶液，置于4℃冰柜摇床上，温和振荡过夜；TBST漂洗5 min，重复3次；二抗反应：将二抗稀释2000倍后与膜室温下温和避光振荡2 h；TBST漂洗5 min，重复3次；用红外成像系统进行扫膜检测。

表2　配胶方法

2　结　果

2.1狼疮定用药后对狼疮模型小鼠脾脏淋巴细胞TGF-β2的表达情况见图1。Western blot法对各组的淋巴细胞TGF-β2蛋白进行电泳实验。结果示，正常组TGF-β2表达极少，而模型组表达明显升高，而中药组表达明显下降。

图1　小鼠脾脏淋巴细胞总蛋白TGF-β2及其β-actin免疫印迹图

2.2狼疮定用药后对狼疮模型小鼠脾脏淋巴细胞JNK的表达情况见图2。Western blot方法对各组的淋巴细胞JNK蛋白进行电泳实验。结果示，正常组小鼠脾脏淋巴细胞JNK表达含量很少，而中药组表达很高，但中药组表达比模型组明显下降。

图2　小鼠脾脏淋巴细胞总蛋白JNK及其β-actin免疫印迹图

2.3狼疮定用药后对狼疮模型小鼠脾脏淋巴细胞Erk的表达情况见图3。Western blot方法对各组的淋巴细胞Erk蛋白进行电泳实验。结果示，正常组Erk表达很高，狼疮小鼠模型组表达下降，中药组用药后，Erk表达仍较少，与模型组区别度不明显。

3　讨　论

SLE是累及全身多个系统，以年轻女性多见，临床表现为面部蝶形红斑，多脏器受累，疾病反复发作，对皮肤黏膜、关节、肾脏、心脏、脑、神经等都有不同程度损害，对人类危害极大。SLE目前尚无法治愈，西医治疗一般采用激素或免疫抑制剂治疗，但其副作用大，同时治疗效果也不突出。因此，研究人员开始研究中药汤剂对SLE的治疗影响。中医认为，SLE与肝肾阴虚、外感热毒、内生毒邪及血瘀内阻的病机关系密切，范永升教授提出解毒祛瘀滋阴法是SLE的基本治法［7］，并提炼出基本方狼疮定。

图3　小鼠脾脏淋巴细胞总蛋白Erk及其β-actin免疫印迹图

TGF-β是由2个结构相同或相似的亚单位借二硫键连接的双体。TGF-β广泛存在于各种细胞中，具有调节细胞分化、生长的功能。TGF-β能够激活Smads的信号转导通路，该通路的活化引起细胞生长抑制，诱导其凋亡［8］。同时TGF-β活化了多条丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路［9］。MAPKs是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。MAPKs信号转导通路存在于大部分细胞内，将细胞外刺激信号传导到细胞及核内，并引发细胞生物学反应，如细胞增殖、分化、转化及凋亡等，在这个过程中，具有至关重要的作用。在哺乳动物中已经发现了3条并行的MAPKs信号通路：ERK信号通路，JNK/SAPK通路，p38/MAPK通路［10］。在多种细胞型中，TGF-β均可使ERK、JNK活化。研究证明，TGF-β可通过MAPK通路介导细胞凋亡。综上所述，TGF-β激活的MAPK级联转导途径在细胞凋亡中具有重要作用。SLE患者的TGF-β-MAPK信号通路相当活跃，介导了大量自身细胞凋亡。凋亡细胞来不及被清除，会作为自身抗原，引起自身免疫应答，导致免疫系统攻击自身组织和器官，包括了肾脏损害，这也是SLE致死的主要原因。

狼疮定全方以青蒿透邪外出、炙鳖甲补阴益肾入络搜邪为君，干地黄清热凉血益阴，白花蛇舌草、升麻清热解毒消斑，赤芍、积雪草活血散血俱为臣，炒薏苡仁、佛手片健脾理气化湿为佐，生甘草解毒并调和诸药为佐使。诸药合用，共奏清热解毒，活血化瘀，益肾养阴之功，达到标本兼治的目的。其中，青蒿中青蒿素及双氢青蒿素具有明显的免疫抑制作用，能抑制BXSB狼疮样小鼠血清ds-DNA抗体的生成，对BXSM小鼠LN有明显的改善作用［11-13］。实验研究表明狼疮定能够减少细胞凋亡，减轻自身免疫应答。

免疫检测中，一抗作用是特异结合底物，二抗作用是可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标记，作用是检测一抗。当一抗结合到底物上，就可以通过二抗检测出来。Western blot结果图中杂带很多可能是一抗的浓度太高对杂带有影响，也可能是封闭不好，有非特异结合。另外上样量也对实验结果有一定的影响，所以笔者比较了50 μg和100 μg上样量，用一抗actin孵育，结果显示，100 μg上样量结果更清晰明亮，所以笔者选择了100 μg的上样量，避免对实验结果影响。

本研究正常组为正常小鼠，模型组为狼疮患病小鼠，中药组为狼疮定用药患病小鼠。若中药组结果趋于正常组，与模型组有一定的区别，说明狼疮定影响此通路，具有治疗作用；反之，则说明狼疮定对该通路无明显影响，无明显治疗作用。TGF-β2和JNK的电泳图显示中药组条带比较浅，明显区别于模型组，趋向于正常组，说明狼疮定影响TGF-β-MAPK信号通路中的蛋白TGF-β2和JNK的分泌，使其含量趋于正常值。本实验用Western blot法来研究狼疮定对在TGF-β-MAPK信号通路上的各个蛋白，主要为TGF-β2、JNK、Erk表达情况的影响，实验结果显示狼疮定对某些关键蛋白有显著影响，如：TGF-β2和JNK。在哺乳动物中，TGF-β激活的MAPK级联转导途径有3条，其中包括了JNK/SAPK通路和ERK信号通路。综上所述，狼疮定影响JNK/SAPK信号通路上蛋白表达，即狼疮定通过影响TGF-β2表达，减少细胞大量凋亡。另外，通过减少JNK表达，影响JNK/SAPK信号通路的传导来控制炎症因子的产生，也正因为如此，SLE患者病情得到控制。因此，狼疮定是通过影响TGF-β-MAPK信号通路，对SLE有一定的治疗作用。本实验用狼疮定对MRL/lpr狼疮小鼠进行药物干预［14-15］，检测TGF-β-MAPK信号通路蛋白的表达情况，探讨狼疮定对SLE小鼠的内在治疗机制，从而为狼疮定治疗SLE提供了理论依据。

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Discussion on the Therapeutic Effect of Langchuangding Decoction on SLE Based on TGF-beta-MAPK Signaling Pathway

XU Chenting，LI Haichang，XIE Zhijun，et al.College of Basic Medicine，Zhejiang University of Chinese Medicine，Hangzhou 310053，China.

R593.24+1

A

1004-745X（2016）05-0769-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.05.006

国家自然科学基金课题（81173249）；2015年度中医药行业科研专项（201507001-4）
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（电子邮箱：wengcp@163.com）

2015-12-11）