5-Fu联合醒脑静干预对绒毛癌致急性脑出血髓鞘相关抑制因子Ephrin-B3的mRNA及蛋白表达的影响

廖学武　罗　丹



5-Fu联合醒脑静干预对绒毛癌致急性脑出血髓鞘相关抑制因子Ephrin-B3的mRNA及蛋白表达的影响

廖学武罗丹

目的探讨5-Fu联合醒脑静干预对绒毛癌致急性脑出血髓鞘相关抑制因子Ephrin-B3的mRNA及蛋白表达的影响。方法选择原发性绒毛癌致急性脑出血患者30例为研究对象，对照组患者(n=15)进行5-氟尿嘧啶(5-Fu)鞘内化疗，治疗组患者(n=15)进行5-Fu鞘内化疗+静脉滴注醒脑静注射液，对2组患者的一般资料(年龄、发生部位、血β-HCG)、Ephrin-B3的mRNA水平及Ephrin-B3蛋白水平进行比较。结果2组患者的一般资料无统计学差异(P>0.05)。治疗后治疗组Ephrin-B3的mRNA水平和Ephrin-B3蛋白水平均低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论5-Fu联合醒脑静干预能明显降低绒毛癌致急性脑出血髓鞘相关抑制因子Ephrin-B3的mRNA水平和蛋白水平。

醒脑静；Ephrin-B3；急性脑出血；绒毛癌

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.07.011

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1078～1080)

醒脑静由天然麝香、冰片、栀子、郁金精制而成，现代药理作用研究显示，其具清除自由基、降低脑脊液中内源性致热原、抑制缺血再灌注诱导的脑神经细胞凋亡、减轻脑水肿、改善脑循环、保护脑细胞等作用，对急性脑出血、中枢性高热和意识障碍等具有显著的治疗作用，且毒副作用小[1-4]。EphrinB3是1种与红细胞生成素诱导的肝细胞受体相互作用的蛋白，主要由巨噬细胞产生，参与大脑防御反应、骨髓造血功能调节及大部分器官系统的自身平衡[5-6]。绒毛膜癌是1种恶性程度很高的肿瘤，绝大多数绒毛癌与妊娠有关，分别继发于葡萄胎、流产或正常分娩之后。绒毛膜癌可发生脑转移，病情严重会引起脑出血，危及患者的生命，治疗多采用静脉联合化疗、鞘内化疗、放射治疗及开颅手术等综合治疗[7-8]。本研究意在探讨5-Fu联合醒脑静干预对绒毛癌致急性脑出血髓鞘相关抑制因子Ephrin-B3的mRNA及蛋白表达的影响。

1　材料与方法

1.1临床资料

选择2011年4月至2015年5月我院收治的原发性绒毛癌致急性脑出血患者30例为研究对象。患者平均年龄(32.5±8.9)岁。所有患者入院时行颅内血肿抽吸，在此基础上，对照组患者(n=15)进行5-氟尿嘧啶(5-Fu)(0.3 g/次)鞘内化疗，治疗组患者(n=15)进行5-Fu鞘内化疗(0.3 g/次)+静脉滴注醒脑静注射液(250 ml 0.9%氯化钠注射液中含30 ml 10 g/kg醒脑静注射液)，连续治疗14天后，行血肿穿刺取少许残血。纳入标准：①经阴道彩色多普勒超声、组织活检诊断仪确诊为绒毛癌且发生脑出血的患者；②头颅CT提示脑出血；③脑出血发病2周内；④出血量在20～40 ml之间。排除标准：①由高血脂、糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、外伤等脑血管的病变引起的脑出血；②伴发其他癌症。

1.2方法

所有患者均进行B超检查、组织活检和头颅CT检查及颅血肿抽吸术。

1.2.1实时荧光定量PCR检测Ephrin-B3基因mRNA的水平抽吸患者颅血，分离淋巴细胞，采用QIAquickRNA Extraction Kit(购自QIAGEN公司，德国)抽提淋巴细胞总RNA。浓度及纯度符合要求的RNA进行合成cDNA第一链，cDNA第一链的合成按照First Strand cDNAsynthesis Kit操作说明(Takara公司，日本)，反应条件为：42 ℃孵育30 min。合成的cDNA第一链放于-20 ℃冰箱保存备用。根据Ephrin-B3基因序列，在Oligo7.5软件上设计Ephrin-B3基因荧光定量(qPCR)引物，引物序列为：Ephrin-B3 F：5’-ATGAAGGTGCTTCTGCGAGT；Ephrin-B3 R：5’-CTGTTGGGGTCACCTGGTAT-3’，扩增片段长度为105 bp。以ACTIN作为参考基因，引物序列为：ACTIN F：5’-CGACGTAGTC TCATCTGAC TT-3’；ACTIN R：5’-GTTGCAGTCGACATAATCGTTGA-3’，片段长度为112 bp。引物均由上海生工有限公司合成。实时荧光定量PCR 20 μl，反应体系为：cDNA第一链1 μl，2xTrans Start Top Green qPCRSuperMix 10 μl，引物1(10 μM)0.6 μl，引物2(10 μM)0.6 μl，Passive Reference Dye 0.4 μl， ddH2O 7.4 μl(试剂购于北京全式金有限公司)，反应在ABI7500荧光定量PCR仪中进行，扩增程序为：95 ℃预变性3 min，95 ℃10 sec；58 ℃20 sec；72 ℃30 s，40个循环。同时进行溶解曲线的分析，程序为：60 ℃ 1 min；95 ℃30 s。在ABI7500分析软件上分析Ephrin-B3及ACTIN基因的Ct值，采用2-△Ct法计算对照组和处理组Ephrin-B3的相对表达量，采用公式Ct=Ct(Ephrin-B3基因)-Ct(ACTIN基因)。

1.2.2酶联免疫吸附法检测血清Ephrin-B3蛋白水平抽吸患者颅血，采用酶联免疫吸附法检测血清Ephrin-B3的水平，具体操作按美国PHOENIX公司Ephrin-B3试剂盒说明书进行。

1.3统计学处理

2　结果

2.12组患者一般资料的比较

对照组和治疗组患者的年龄、绒毛膜癌脑转移发生部位及血清β-HCG水平均无统计学差异(P>0.05)，见表1。

表1　2组患者一般资料的比较

2.22组患者Ephrin-B3基因mRNA水平的比较

对照组EphrinB3 mRNA的水平为(2.68±0.75)，高于治疗组EphrinB3 mRNA的水平为(1.05±0.33)，差异具有统计学意义(t=7.704，P<0.0001)。

2.32组患者Ephrin-B3蛋白水平的比较

对照组Ephrin-B3蛋白水平为(233.42±21.41)，高于治疗组Ephrin-B3蛋白水平(162.37±33.10)，差异具有统计学意义(t=6.980，P<0.0001)。

3　讨论

绒毛膜癌是一种恶性程度很高的肿瘤，近年来应用化学药物治疗，使绒毛癌的预后有了显著的改观。绒毛膜癌可发生脑转移，病情严重者可发生脑出血[9]，治疗多采用静脉联合化疗、鞘内化疗、放射治疗及开颅手术等综合治疗，但绒毛癌的化疗过程中，会出现造血功能障碍等副作用，引起白细胞下降引起的败血症和血小板下降引起的出血，包括脑出血。脑出血的发生会影响整个神经-大脑-内分泌网络的正常机能，降低机体的抗感染和抗肿瘤能力，情况严重者危及患者的生命[10]。EphrinB3是一种与红细胞生成素诱导的肝细胞受体相互作用的蛋白，主要由巨噬细胞产生，参与大脑防御反应、骨髓造血功能调节及大部分器官系统的自身平衡，在脑出血发生、发展和转归过程中起一定的作用[11]。醒脑静由天然麝香、冰片、栀子、郁金精制而成，具有清热解毒，凉血活血，开窍醒脑之功效，现代药理研究显示醒脑静能保护脑出血患者的脑组织，改善脑缺血患者的意识状态，可明显降低脑出血患者血神经肽Y和脑水肿的水平，能有效抑制脑出血患者炎症细胞因子的释放，控制各细胞因子水平的变化情况，激活体内SOD，清除颅内氧自由基，抑制炎性因子TNF-α，促进造血及促进血管内皮细胞增殖，对脑出血患者有利[12-14]。而EphrinB3在脑出血发生、发展和转归过程中发挥着重要的作用[15]，鉴于此，本文就醒脑静对Ephrin-B3表达水平的影响进行研究。

本研究通过5-Fu联合醒脑静干预绒毛癌致急性脑出血患者，研究干预后髓鞘相关抑制因子Ephrin-B3的mRNA及蛋白表达，从Ephrin-B3角度探讨醒脑静在绒毛癌致急性脑出血治疗作用的一个分子机制。通过荧光定量PCR，以ACTIN为参考基因，研究Ephrin-B3的mRNA水平，结果显示，经5-Fu联合醒脑静治疗的患者Ephrin-B3的mRNA水平明显低于仅通过5-Fu治疗的患者，差异具有统计学意义(P<0.05)。Ephrin-B3蛋白水平的检测结果显示，经5-Fu联合醒脑静治疗的患者Ephrin-B3的蛋白水平明显低于仅通过5-Fu治疗的患者Ephrin-B3的蛋白水平，差异具有统计学意义(P<0.05)，表明醒脑静能降低绒毛癌致急性脑出血患者Ephrin-B3的mRNA水平和蛋白水平，可能为醒脑静治疗绒毛癌致急性脑出血的分子机制。在绒毛癌致急性脑出血患者中，多数患者主要为脑白质区的出血，据研究报道[16]，Ephrin-B3作为一种髓鞘相关抑制因子，与脑白质的损伤有关，脑白质在神经系统中起着传递信息，分泌和支撑神经元、保护和营养神经纤维等作用，其脑白质损伤对机体会产生不利的影响，引起神经纤维的断裂、变性甚至坏死，表明Ephrin-B3水平的降低在脑出血发生、发展和转归过程中起一定的作用。

综上所述，醒脑静能降低绒毛癌致急性脑出血患者Ephrin-B3的水平，这可能是醒脑静在绒毛癌致急性脑出血患者中起治疗作用的一个分子机制，然而其具体的机制和通路仍有待进一步研究。

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(编辑：甘艳)

Effect of 5-Fu combined with Xingnaojing Intervention on Ephrin-B3 mRNA and ItsProtein Expression in Patients with Acute Cerebral Hemorrhage Induced byChoriocarcinoma

LIAOXuewu，LUODan.

People'sHospitalofDazuDistrict，Chongqing，402360

ObjectiveTo study the effects of 5-Fu combined with Xingnaojing intervention on Ephrin-B3 mRNA and its protein expression in patients with acute cerebral hemorrhage induced by choriocarcinoma.Methods30 female patients with primary intracranial brain metastases from choriocarcinoma were selected.The control group (n=15)were treated with 5-fluorouracil (5-Fu) sheath.The treatment group (n=15)were treated with 5-Fu combined with Xingnaojing intravenously.The clinical features (age，location，serum β-HCG)，mRNA and protein levels of Ephrin-B3 of the 2 groups were compared.ResultsGeneral information in the 2 groups showed no significant difference(P>0.05)，while mRNA and protein levels of Ephrin-B3 in the treatment group were lower than the control group，there had statistically significant difference (P<0.05).ConclusionThe intervention of 5-Fu combined with Xingnaojing can significantly reduce the mRNA and protein levels of Ephrin-B3 in patients with acute cerebral hemorrhage induced by choriocarcinoma.

Xingnaojing；Ephrin-B3；Acute cerebral hemorrhage；Choriocarcinoma

402360 重庆市大足区人民医院

罗丹

R730.5

A

1001-5930(2016)07-1078-03

2015-09-07

2015-12-21)