Hsp90AB1在非小细胞肺癌中高表达并且与肺腺癌患者不良预后相关

王明慧 冯林 李萍 韩廼珺 高燕宁 肖汀

热休克蛋白90（heat shock protein, Hsp90）是ATP依赖的高度保守的分子伴侣，其可利用ATP水解产生的能量参与蛋白质的正确折叠，稳定蛋白质结构，参与细胞信号转导激素应答及转录调控等反应以及肿瘤凋亡、增殖相关通路的调节[1,2]。Hsp90对因环境改变等各种应激状态下蛋白质稳定性的保持至关重要[1]。除了在正常细胞中发挥重要作用外，Hsp90与底物蛋白相结合参与多种疾病的发生发展，如恶性肿瘤、自身免疫性疾病。他还是多种致癌蛋白的分子伴侣，包括表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）、人类表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2, HER2）、间质表皮转化因子（mesenchymal-epithelial transition, MET）、蛋白激酶B（protein kinase B, AKT）等[3]。目前认为，人类Hsp90主要包括4种亚型：Hsp90AA1和Hsp90AB1均位于胞质内，Grp94位于内质网中，而TRAP1亚型则定位于线粒体基质内。Hsp90AA1和Hsp90AB1有85%同源，但是两者作用不同，Hsp90AA1是诱导性表达，参与应激状态下细胞保护和细胞周期的调节，而Hsp90AB1是组成性表达，参与早期胚胎发育、信号转导及细胞长期适应性[4]。

目前在世界范围内，肺癌发生率和死亡率均居恶性肿瘤首位，其中约85%为非小细胞肺癌[5]。作为分子伴侣，Hsp90有助于多种促肺癌蛋白质的折叠和成熟，例如EGFR和ALK。阻断这些伴侣蛋白发挥功能是癌症治疗中的一种全新策略。Ramalingam等[6]对Hsp90新型抑制剂ganetespib的一项临床II期研究发现，在治疗晚期肺腺癌患者过程中，ganetespib与多西他赛（docetaxel）联合用药治疗与多西他赛单药治疗相比，可延长晚期肺腺癌患者的总生存期。本研究采用免疫组织化学染色方法检测Hsp90AB1在213例非小细胞肺癌组织中的蛋白表达水平，分析其与非小细胞肺癌临床病理参数及患者预后的关系，为Hsp90抑制剂在肺腺癌患者的临床用药提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 标本 肺癌组织微阵列：上海芯超生物科技有限公司，（HLug-Scc150Squ-01, HLug-Ade150Sur-01），手术时间2004年7月-2007年11月，随访时间截止至2012年7月；上海卓立生物科技有限公司（LUC1505），手术时间2005年7月-2011年12月，随访时间截止至2013年6月。三张组织芯片共包含213例肺癌组织和相应的癌旁肺组织（距离肿瘤组织3 cm以外的正常肺组织），其中肺鳞癌66例，肺腺癌147例。

1.2 免疫组化试剂 一抗为Hsp90AB1兔多克隆抗体（货号：AP7867d，Abgent，美国），工作浓度是1:100；二抗为山羊抗兔IgG/HRP（中杉金桥，中国）；30%H2O2溶液（西陇化工，中国）；10×抗原修复液（柠檬酸盐缓冲液，0.01 M，pH6.0）（中杉金桥，中国）；正常山羊血清（中杉金桥，中国）；20×DAB显色试剂盒（中杉金桥，中国）；苏木素染料（中杉金桥，中国）。

1.3 免疫组化实验步骤（SP法） 组织芯片置于65 ℃烤箱中，烘烤3 h；经脱蜡、水化后放置于3%的H2O2溶液中室温避光孵育10 min，以除去细胞内源性过氧化物酶的活性；抗原修复液进行抗原修复；正常山羊血清封闭液室温封闭10 min；弃封闭液，用一抗工作液（Hsp90AB1兔多克隆抗体，1:100）4 ℃孵育过夜；滴加生物素化的二抗工作液（山羊抗兔IgG），室温孵育30 min；DAB显色，显微镜下控制染色强度；苏木素染色；树脂封片，显微镜下观察[7,8]。

1.4 结果判定 免疫组化染色结果由两位独立临床病理医师阅片判断。根据细胞染色强度评分和阳性细胞比例评分的乘积进行半定量分析。按细胞染色强度评分：0分（无棕黄色颗粒），1分（淡黄色颗粒），2分（棕黄色颗粒），3分（褐色颗粒）；按阳性细胞比例评分：0分（阳性细胞比例≤5%），1分（5%＜阳性细胞比例≤25%），2分（25%＜阳性细胞比例≤50%），3分（50%＜阳性细胞比例≤75%），4分（75%＜阳性细胞比例≤100%）。结果取两者之积，分为4级：0记为（-），1-4记为（+），5-8记为（++），9-12记为（+++）。将（-）和（+）定为蛋白表达阴性，将（++）和（+++）定为蛋白表达阳性。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0（SPSS INC，美国）和SigmaPlot 12.3（Systat Software，San Jose，美国）软件进行数据统计分析。生存期计算从手术日期开始到随访日期终止，或由于复发、转移而死亡的日期或失访日期终止。采用卡方检验分析肺癌中Hsp90AB1的表达与各临床参数之间的关系，采用Kaplan-Meier计算肺腺癌患者的生存曲线，并进行对数秩检验，用Cox多因素回归分析各种因素对肺腺癌患者总生存期的影响。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Hsp90AB1在非小细胞肺癌组织中高表达 免疫组化结果显示Hsp90AB1阳性表达部位主要是肺癌细胞的胞浆，呈棕黄色颗粒状弥漫分布在肺癌细胞胞浆中（图1，图2B、图2C）。免疫组化检测213例非小细胞肺癌，其中115例肺癌组织中Hsp90AB1呈阳性表达，阳性率为54.0%。Hsp90AB1在正常癌旁肺组织中几乎不表达（图2A）。

2.2 Hsp90AB1表达与肺癌病理类型相关 213例肺癌组织中，有147例肺腺癌，66肺鳞癌，其中Hsp90AB1在肺鳞癌中的阳性表达率为37.9%，在肺腺癌中的阳性表达率为61.2%（表1，图2B、图2C），差异有统计学意义（P=0.002）。Hsp90AB1在非小细胞肺癌组织中的表达与肿瘤的临床分期、淋巴结转移、病理分级等因素无相关性（P＞0.05）。Hsp90AB1的表达水平与各临床参数之间的关系总结见表1。

图1 运用Hsp90AB1兔多克隆抗体在组织芯片中用免疫组织化学染色方法检测Hsp90AB1在肺腺癌组织中的表达（×400）。A-D分别表示Hsp90AB1在肺腺癌组织中的染色强度为（+++）、（++）、（+）、（-）。Fig 1 Hsp90AB1 protein expression in lung adenocarcinoma tissues, as observed by immunohistochemical staining with a rabbit polyclonal antibody against Hsp90AB1, applied to formalin-fixed and paraffin-embedded tissues in the manner of tissue microarrays (Original magnification:×400). A-D: The expression intensities of Hsp90AB1 immunostaining in lung adenocarcinoma tissues were (+++), (++), (+), (-), respectively.Hsp90AB1: heat shock protein 90 kDa alpha, class B member 1.

图2 运用Hsp90AB1兔多克隆抗体在组织芯片中用免疫组织化学染色方法检测Hsp90AB1在正常肺组织和肺癌组织中的表达。A：Hsp90AB1在癌旁正常肺组织中不表达（×100）；B：Hsp90AB1在肺鳞癌组织中低表达（×200）；C：Hsp90AB1在肺腺癌组织中高表达（×400）。Fig 2 Hsp90AB1 protein expression in normal lung tissues and lung cancer tissues, as obser ve d by immunohistochemical staining with a rabbit polyclonal antibody against Hsp90AB1, applied to formalin-fixed and paraffin-embedded tissues in manner of tissue microarrays. A: Hsp90AB1 was not expressed in normal lung tissues (×100);B: Low expression of Hsp90AB1 in lung squamous cell carcinoma tissues (×200);C: High expression of Hsp90AB1 in lung adenocarcinoma tissues (×400).

2.3 Hsp90AB1表达与肺腺癌预后相关 本研究中上海芯超和上海卓立科技有限公司的两张组织芯片共包含147例肺腺癌组织，两个公司的组织芯片构成病例在男女性别，临床分期、分化程度等临床参数的组成比例无明显差别。随访时间0.06年至8.0年，中位随访时间3.4年。Hsp90AB1阳性表达的肺腺癌患者总生存率低于Hsp90AB1阴性表达的患者（P=0.032，图3）。Cox多因素回归分析结果显示，Hsp90AB1可以作为预后的独立因素（表2，P=0.002）。

3 讨论

目前已经发现超过200种蛋白与Hsp90相互作用成为其底物蛋白，大多数的这些底物蛋白参与必要的细胞增殖，细胞周期进程和细胞凋亡调控，包括类固醇激素受体、激酶、转录因子、HER2、Akt、突变型P53等[9,10]。Hsp90在调节底物蛋白构象的正确折叠、稳定性及功能方面具有核心作用[11]。Hsp90底物蛋白有多种是致癌蛋白，其对致癌蛋白的稳定性和功能的发挥具有关键作用。肿瘤的一些特征性变化都与这些致癌蛋白相关，如持续的抗凋亡、血管生成及组织浸润和转移[12]。

目前在世界范围内肺癌是死亡率最高的恶性肿瘤，占癌症死亡总数的三分之一，非小细胞肺癌占85%的肺癌病例，其中肺腺癌是非小细胞肺癌的主要组织学类型[13]。目前关于Hsp90在肺癌组织中蛋白表达情况的研究较少。我们研究发现，Hsp90AB1在肺腺癌组织中的阳性表达率为61.2%，高于在肺鳞癌中的表达。Hsp90AB1在肺腺癌组织中表达高的原因之一是EGFR在肺腺癌中的突变率高，而EGFR是Hsp90AB1的一种底物蛋白，据相关研究[14]显示EGFR在白种人群肺腺癌中的突变率约为15%-20%，在亚洲人群肺腺癌中的突变率高达50%。此外我们的研究结果还显示Hsp90AB1的高表达与肺腺癌的不良预后相关，Cox多因素回归分析表明Hsp90AB1可作为影响肺腺癌预后的独立危险因素。此结果与文献报道的Hsp90在其他肿瘤的表达情况一致，Wang等[15]通过免疫组化法在322例胃癌样本中研究结果显示Hsp90与胃癌的侵袭、转移及预后相关。Shirota等[16]研究发现Hsp90在胆管癌中的表达与胆管癌的5年生存率明显相关。此外，也有研究[17,18]发现Hsp90与乳腺癌的预后相关。这些研究结果提示高表达Hsp90可以作为判断某些癌症患者预后的标志物，为肿瘤患者手术后的治疗提供参考。

表1 肺癌中Hsp90AB1的表达与临床病理参数之间的关系Tab 1 Correlation between clinicopathological features and Hsp90AB1 expression in lung cancer

表2 肺腺癌患者总生存期的Cox多因素回归分析Tab 2 Multivariate Cox regression analysis for overall survival in lung adenocarcinoma patients

图3 Kaplan-Meier生存分析显示Hsp90AB1阳性组（n=90）肺腺癌患者比阴性组（n=57）预后差，横坐标表示患者的生存时间，纵坐标表示累计生存率。Fig 3 The Kaplan-Meier survival analysis revealed that the lung adenocarcinoma patients with Hsp90AB1 positive expression (n=90)had a significantly poorer outcome than those with Hsp90AB1 negative expression (n=57)(P=0.032). The abscissa represents the patient's survival time and the vertical axis indicates survival probability.

Hsp90能够帮助癌细胞克服各种不良应激刺激，如缺氧、蛋白质毒性压力以及营养物质缺乏等，并且他还能保护癌细胞逃避免疫系统的攻击[19,20]。正是因为Hsp90的这一特点使得其成为癌症治疗的一个极具价值的靶点。目前针对Hsp90抑制剂的研究较多，Ueno等[21]在研究AUY922对几种已发生遗传改变，包括EGFR突变的非小细胞肺癌细胞系的抗肿瘤实验结果表明，AUY922不仅在EGFR突变的肿瘤，而且在非EGFR突变但含有K-ras突变或EML-ALK基因融合等分子改变的肿瘤细胞中抗肿瘤作用明显增强。并且其在胆管癌细胞中也发挥着抗生长和抗血管生成的作用[15]。所以，AUY922有望成为新型抗肿瘤药物。Gomez-Casal等[22]研究Hsp90另一种抑制剂Ganetespib发现其可以抑制肺腺癌细胞增殖、迁移，诱导肺腺癌细胞凋亡，并且可以增加肺腺癌细胞体外放射敏感性。本研究的结果表明Hsp90AB1在肺腺癌组织中表达阳性率为61.2%，且这部分Hsp90AB1高表达的患者预后较差。如果针对Hsp90阳性表达的患者使用Hsp90抑制剂将更有针对性，提高用药的有效率。

综上所述，肺癌组织中Hsp90AB1高表达，尤其在肺腺癌组织中阳性表达是患者预后的独立因素，为临床上使用Hsp90抑制剂作为肺腺癌靶向药物提供理论基础，更能针对性用药。