功能化纳米金比色检测水中Cr3+

陈　镇，崔海霞，申　佳，何枫洁，丁　露，刘慧龙，熊兴良

(重庆医科大学　生物医学工程研究室，重庆　400016)



功能化纳米金比色检测水中Cr3+

陈镇，崔海霞，申佳，何枫洁，丁露，刘慧龙，熊兴良*

(重庆医科大学生物医学工程研究室，重庆400016)

采用柠檬酸钠还原法制备粒径13 nm的金纳米颗粒(AuNPs)作为比色信号报告分子,3-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑(AMT)作为Cr3+的识别分子，构建了一种水中Cr3+的比色传感检测方法。将AMT修饰于AuNPs表面，形成稳定的AMT-AuNPs水溶复合物；根据AMT与Cr3+之间的特异性结合，引起溶液中AMT-AuNPs聚集，进而导致溶液颜色由红色变为蓝紫色以及最大吸收峰红移的现象，实现了水中Cr3+的比色检测。在优化实验条件(AMT修饰浓度为0.8 μmol/L，pH 7.0)下，该方法的检测范围为6～14 μmol/L,检出限可达100 nmol/L，其他重金属离子几乎不存在干扰。由于该方法具有响应快(5 min)、制备和操作简单、无需读取装置等优点，可望用于水体中Cr3+的现场快速检测。

Cr3+检测；3-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑；纳米金；比色传感器；水

重金属铬(Cr)在水溶液中主要以Cr3+和Cr6+形式存在，两种价态之间可相互转换。Cr3+是人体必需的微量元素，对调节体内糖代谢、维持正常的葡萄糖耐量起重要作用，同时还能影响机体的脂质代谢，降低血中胆固醇和甘油三酯的含量。此外，Cr3+还是DNA和RNA的稳定剂，可防止细胞内某些基因的突变，从而预防癌症。但体内过量摄入的Cr3+则会与DNA结合，影响细胞结构和破坏细胞的组成成分，甚至诱发肿瘤[1]。此外在电镀行业，电镀液中Cr3+含量的控制对保证镀铬层的质量也起着至关重要的作用[2]。因此开发一种快速、高灵敏检测水中Cr3+的简单方法尤为必要。但是，目前广泛采用的原子吸收光谱法和电感耦合等离子质谱法[3-4]均存在费时、仪器昂贵以及操作繁琐等问题。近年提出的一些用于Cr3+检测的荧光化学传感器虽克服了以上缺点，但普遍存在制备难度大、检出限过高等不足[5-6]。

物理性质上，纳米金(AuNPs)具有高摩尔消光系数、大比表面积,以及聚集程度与粒子尺寸和粒子间距相关等独特的光学性质；化学性质上，AuNPs具有非常容易实现表面功能化处理等优点[7]，因而在重金属离子检测中备受关注[8-9]。目前已有诸多文献报道利用无标记AuNPs或生物化学分子(DNA、蛋白质、肽以及小分子)修饰的AuNPs检测Hg2+，Pb2+，Cu2+，Cd2+和Cr6+等重金属离子[8,10-14]。在检测Cr3+方面也有少量报道，如Xin等[15]和Dang等[16]分别用三聚磷酸盐和二巯基对硝基苯甲酸修饰的AuNPs检测溶液中Cr3+。但这些方法在选择性或灵敏度上有待提高。

本文利用3-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑(AMT)作为Cr3+的识别分子，粒径为13 nm 的AuNPs作为比色信号报告分子，将AMT修饰于AuNPs表面，形成AMT-AuNPs复合物，利用Cr3+与复合物混合前后颜色的变化，构建了一种快速、可视化检测水中Cr3+的比色传感方法。该方法的检测灵敏度为100 nmol/L，且对Cr3+具有非常高的选择性。

1　实验部分

1.1试剂与仪器

氯金酸(HAuCl4·4H2O)、3-氨基-5-巯基-1,2,4-三唑(AMT)均为分析纯，购自Sigma-Aldrich公司；柠檬酸三钠(分析纯，上海生工生物试剂公司)；氯化镁、氯化钴、氯化汞、硝酸铝、硝酸铬、硝酸锰、硝酸铜、硝酸镉、硝酸铅(分析纯，上海强顺化学试剂公司)。实验用缓冲液为10 mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液，用0.1 mol/L的NaOH或盐酸调节pH值。实验用水为电阻率≥18.25 MΩ·cm的超纯水，实际分析水样取自重庆医科大学校园人工渠水。

Multiskan GO全波长酶标仪(美国赛默飞世尔科技)；756S紫外-可见分光光度计(上海棱光技术公司)；Hitachi-7500透射电子显微镜(日本日立公司)；PowerShot SD1100 IS佳能数码相机；78HW-1恒温磁力搅拌器(江苏金坛环宇科学仪器)；FA/JA型系列电子天平(上海舜宇恒平科学仪器)；UPH-Ⅱ-20T优普超纯水制造系统(成都优普超纯科技有限公司)。

1.2AuNPs的制备与修饰

AuNPs的合成参考Turkevich-Frens法[17-18]：250 mL圆底烧瓶中加入100 mL 0.01%的HAuCl4溶液，持续搅拌条件下油浴加热至沸腾，迅速加入3 mL 1%的柠檬酸三钠溶液，保持溶液沸腾15 min，停止加热，继续搅拌自然冷却至室温。制备的AuNPs溶液于4 ℃贮存备用。

AMT修饰AuNPs方法：将不同浓度的AMT溶液分别与AuNPs溶液混合均匀，配成AMT终浓度在0.2～2.0 μmol/L范围的系列梯度混合溶液，调节混合溶液pH值，室温反应过夜后，离心再分散于不同pH值 的HEPES缓冲液中，即得AMT-AuNPs溶液。

1.3分析方法

500 μL AMT-AuNPs溶液中加入不同浓度的Cr3+或其他金属离子，混合均匀，5 min后观察溶液颜色变化，并进行紫外-可见吸收光谱扫描和TEM表征。

2　结果与讨论

2.1AMT-AuNPs溶液的稳定性

按上述方法制备的AuNPs溶液光谱在520 nm处出现吸收峰(图1a)。根据Haiss与Khlebtsov的研究[19-20]，计算出AuNPs的平均粒径约为13 nm；另据AuNPs在520 nm处的摩尔吸光系数为5.0×108L/(mol·cm)[21]，计算其浓度约为3.0 nmol/L。

众所周知，AuNPs与—SH之间有很强的共价作用，因而含—SH的AMT分子非常容易固定于AuNPs表面形成AMT-AuNPs复合物。AMT-AuNPs复合物溶液的吸收光谱如图1b所示，其吸收峰仍为520 nm ，说明经AMT修饰后绝大多数AuNPs的颗粒尺寸未发生明显变化，这是由于AuNPs的粒径远大于AMT分子，因此表面修饰AMT后，几乎不影响AMT-AuNPs复合物的平均粒径。图1b中650 nm处的吸光度略有上升，表明仅有极少量的AMT-AuNPs复合物发生了轻微的聚集。后续AMT-AuNPs溶液的TEM结果也证实其处于很好的分散状态。因此，AMT-AuNPs溶液体系具有较好的稳定性。

实验进一步考察了不同pH值下AMT-AuNPs溶液的稳定性。发现当pH≥5.0时，AMT-AuNPs溶液体系能保持长时间稳定；pH<5.0时，AMT-AuNPs溶液变为蓝紫色，说明此时溶液体系不稳定，发生了聚集。

2.2比色检测Cr3+原理

AuNPs比色检测Cr3+的原理如图2所示，实验选取AMT为 Cr3+的识别分子，AMT分子结构中含有—SH，—NH2以及杂环N原子等功能基团。其中—SH用于共价固定于AuNPs表面并形成稳定的AMT-AuNPs复合物。当溶液中不存在Cr3+时，复合物在溶液中呈稳定分散态，溶液颜色为红色(图2A)；而当溶液中存在Cr3+时，Cr3+通过与AuNPs表面上AMT分子中的—NH2和杂环N原子之间发生络合作用(图2B)，导致AuNPs颗粒之间的间距缩小而聚集，由于AuNPs具有距离依赖的颜色响应，从而导致溶液颜色由红色变为蓝紫色(图2C)。光谱图表现为吸收峰红移(图1c)。AMT-AuNPs溶液中加入Cr3+前后的TEM图像(图3)也可清楚地观察到颗粒由均匀分散态转变为聚集态。

2.3检测条件的优化

2.3.1AMT浓度的影响图4为pH 7.0条件下，用不同浓度(0.2～2 μmol/L)AMT修饰AuNPs后，AMT-AuNPs溶液的紫外-可见吸收光谱。由图可见，随AMT浓度的增加，A650/A520的值逐渐增大(图4插图曲线a)，AMT-AuNPs溶液的吸收光谱红移逐渐明显，表明经高浓度AMT修饰后溶液中部分AuNPs开始聚集，AMT-AuNPs稳定性开始下降。在上述溶液中分别加入相同浓度的Cr3+(20 μmol/L)后，表征溶液体系响应的光谱比值A650/A520先逐渐增加，后趋于平缓(如图4插图曲线b)。综合考虑背景干扰和灵敏度，实验选取修饰AuNPs的AMT浓度为0.8 μmol/L。

2.3.2pH值的影响溶液体系pH值会影响AMT-AuNPs的稳定性以及检测的选择性。实验发现，当溶液pH≤5.0时，在未加入Cr3+情况下，溶液为蓝紫色，说明AMT-AuNPs颗粒已发生聚集。其原因可能为过量的H+中和了AuNPs表面的负电荷，降低了AuNPs间的静电排斥，从而导致AMT-AuNPs发生聚集。而当溶液在pH 5.0～10.0时，溶液体系对Cr3+的响应随pH值的增加，呈现先增强后减弱现象。这可能是由于溶液中两种相反趋势共同作用的结果。一种是AMT-AuNPs本身的聚集变色反应在一定范围内随溶液pH值的增加变强；另一种是随溶液pH值的增加，体系中的Cr3+因与OH-结合(包括水解或产生沉淀)逐渐减少，从而与AMT配位引起AMT-AuNPs聚集的Cr3+减少，导致溶液体系对Cr3+的响应随pH值增加而减弱。溶液pH值对响应结果影响的详细机理仍待进一步研究。此外，当溶液pH≥8.0后，其他金属离子对Cr3+检测的干扰也逐渐增强。综上，选取pH 7.0作为较优化反应条件。

2.4传感性能

2.4.1响应时间在上述优化条件下，向AMT-AuNPs中加入20 μmol/L Cr3+后，体系对Cr3+的响应(A650/A520)在5 min后即趋于稳定，并在72 h内保持稳定，说明本方法具有快速可靠的特点，且稳定时间长。

2.4.2检出限与检测范围在上述优化条件下，在AMT-AuNPs溶液中分别加入不同浓度(0～20 μmol/L)的Cr3+，反应5 min。结果发现，无Cr3+存在时，溶液保持红色不变；Cr3+浓度为2 μmol/L时，即可观察到红色变深；随Cr3+浓度的增加，溶液逐渐由红色变为蓝紫色，且在520 nm处的吸光度逐渐降低，而在650 nm处的吸光度则逐渐增加最后趋于稳定。体系对不同浓度Cr3+的响应表明，在6～14 μmol/L浓度范围内，A650/A520(y)与Cr3+浓度(x,μmol/L)呈良好的线性关系，线性方程为y=0.113 5x-0.307 7，r2=0.990 6。以信噪比S/N=3计算，本方法的检出限可达100 nmol/L。

2.4.3选择性考察了AMT-AuNPs传感体系对水环境中常见重金属离子的响应情况(见图5)。结果显示，除Cr3+出现明显的颜色变化外，其他离子均未出现颜色变化，说明该方法具有很好的选择性。金属离子与化学分子间的亲和程度取决于化学分子的基团分布、空间构象以及金属离子本身的半径、电荷数等因素。固定化的AMT对Cr3+具有高选择性的原因推测为：首先，AMT分子结构中含有的—NH2和杂环N原子等功能基团对重金属离子具有很好的亲和性(但不具有选择性)，这保证了Cr3+与AMT的可结合性；其次，AMT分子杂环上的N与环上邻近的—NH2构成了一个类似于“Y”型的空间构象(如图2C)。该“Y”型结构中凹槽区域的尺寸可能与Cr3+的半径匹配，使与Cr3+半径相当的离子进入该结构；同时，该“Y”型结构与金属离子之间的亲和程度还与离子所带电荷数有关，推测带3个正电荷的Cr3+与AMT的“Y”型结构具有最强的结合能力，这保证了AMT对Cr3+的选择性。详细的结合机理有待进一步研究。

2.5实际水样分析

向预处理过的100 mL水样中加入不同浓度的Cr3+标准溶液，分别取10 μL按照本方法进行测定，在本方法线性浓度范围内对Cr3+进行7.00,9.00,13.00 μmol/L 3个水平的加标回收实验，计算得回收率为95%～108%，相对标准偏差(RSD，n=5)为2.1%～4.6%，说明本方法有望用于实际水样中Cr3+的检测分析。

3　结　论

基于Cr3+能引起AMT修饰的AuNPs发生聚集导致溶液颜色发生变化，构建了一种 AMT-AuNPs比色传感器，实现了对水中Cr3+的快速检测，其检出限为100 nmol/L，大多数重金属离子不干扰测定；同时，该方法具有无需昂贵仪器、操作简单、成本低等优点。因此，在水环境中Cr3+的检测方面具有很好的应用前景。

[1]Bagchi D,Stohs S J,Downs B W,Bagchi M,Preuss H G.Toxicology,2002,180(1):5-22.

[2]Tu Z M,Zheng J,Li N,Li Y Y.Surf.Technol.(屠振密，郑剑，李宁，李永彦.表面技术)，2007,36:59-63.[3]Suo W G,Hu Q Y,Chen Z G,Wang F.Chin.J.Appl.Chem.(索卫国，胡清源，陈再根，王芳.应用化学)，2008,25(2):208-211.

[4]Hosseini M S,Belador F.J.Hazard.Mater.,2009,165(1/3):1062-1067.

[5]Huang K W,Yang H,Zhou Z G,Yu M X,Li F Y,Gao X,Yi T,Huang C H.Org.Lett.,2008,10(10):2557-2560.[6]Zhou Z,Yu M,Yang H,Huang K,Li F,Yi T,Huang C.Chem.Commun.,2008,29(29):3387-3389.

[7]Saha K,Agasti S S,Kim C,Li X,Rotello V M.Chem.Rev.,2012,112(5):2739-2779.

[8]Qi H J,Chen W W,Yue L J,Wang Z,Meng Y,Liu X L.J.Environ.Chem.(戚红卷，陈雯雯，岳丽君，王卓，孟洋，刘雪林.环境化学)，2013,32(1):21-28.

[9]Cui L,Wu J,Ju H X.Biosens.Bioelectron.,2015,63:276-286.

[10]Liu J C,Lü Z Z,Chen A L.Spectrosc.Spectrom.Anal.(刘金钏，吕珍珍，陈爱亮.光谱学与光谱分析)，2014,(8):2040-2046.

[11]Wu Y G,Zhan S S,Wang L M,Zhou P.Analyst,2014,139(6):1550.

[12]Tan F,Liu X,Quan X,Chen J W,Li X N,Zhao H X.Anal.Methods,2011,3(2):343-347.

[13]Tan F,Liu X.J.Instrum.Anal.(谭峰，刘学.分析测试学报)，2010,29(8):850-854.

[14]Wang Y X,Bo H Y,Lin K,Wang X,Gao Q.J.Instrum.Anal.(王云香，薄红艳，蔺凯，王晓，高强.分析测试学报)，2011,30(7):804-807.

[15]Xin J W,Miao L J,Chen S G,Wu A G.Anal.Methods,2012,4(5):1259-1264.

[16]Dang Y Q,Li H W,Wang B,Li L,Wu Y.ACSAppl.Mater.Interfaces,2009,1(7):1533-1538.

[17]Turkevich J,Stevenson P C,Hillier J.Discuss.FaradaySoc.,1951,11(11):55-75.

[18]Frens G.Nature,1973,241(105):20-22.

[19]Haiss W,Thanh N T K,Aveyard J,Fernig D G.Anal.Chem.,2007,79(11):4215-4221.

[20]Khlebtsov N G.Anal.Chem.,2008,80(17):6620-6625.

[21]Liu X,Atwater M,Wang J H,Huo Q.ColloidsSurf.B,2007,58(1):3-7.

Colorimetric Detection of Cr3+in Aqueous Solution Using AMT-modified Gold Nanoparticles

CHEN Zhen，CUI Hai-xia，SHEN Jia，HE Feng-jie，DING Lu，LIU Hui-long，XIONG Xing-liang*

(Department of Biomedical Engineering,Chongqing Medical University,Chongqing400016,China)

A colorimetric method was developed to determine chromium ions(Cr3+) in water,by using 13 nm diameter gold nanoparticles(AuNPs) synthesized by the citrate-mediated reduction of HAuCl4as the transducer component for signaling color change,and 3-amino-5-mercapto-1,2,4-triazole(AMT) as the recognition element for Cr3+.AMT was assembled onto the surface of AuNPs to form a stable water-soluble AMT-AuNPs compound.In the presence of Cr3+,the specific binding of AMT and Cr3+in solution could lead to the aggregation of AMT-AuNPs and a red shift of the maximum absorption wavelength,simultaneously producing an obvious color change from red to blue-purple,which could be used for Cr3+visual detection.Under the optimized conditions(concentration of AMT:0.8 μmol/L；pH 7.0),the detection limit(3σ) of the method could be as low as 100 nmol/L for Cr3+with linear detection range of 6-14 μmol/L,and there was almost no interference from other metal ions.With the advantages of fast response(5 min)，simplicity of preparation and manipulation,and no need of reading device,the presented method is promising in the application of on-site fast detection of Cr3+in water.

Cr3+detection；3-amino-5-mercapto-1,2,4-triazole；gold nanoparticles；colorimetric sensor；water

2015-11-08；

2015-12-28

重庆市基础与前沿研究计划(cstc2015jcyjA20014)

熊兴良，博士，教授，研究方向：生物传感器，Tel：023-68485446，E-mail：xxlsober@sina.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.008

O657.3；O614.41

A

1004-4957(2016)06-0681-05