超高效液相色谱-串联质谱法测定草莓中19种农药残留量

马　琳，黄兰淇，陈建波，尹　君，占绣萍，赵　莉*

(1.上海市农业技术推广服务中心，农业部农药质量监督检验测试中心(上海)，上海　201103；2.上海市浦东新区农产品安全中心，上海　2012021)



超高效液相色谱-串联质谱法测定草莓中19种农药残留量

马琳1，黄兰淇1，陈建波1，尹君2，占绣萍1，赵莉1*

(1.上海市农业技术推广服务中心，农业部农药质量监督检验测试中心(上海)，上海201103；2.上海市浦东新区农产品安全中心，上海2012021)

建立了超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)同时测定草莓中19种农药的快速、灵敏分析方法，并将此方法应用于草莓中农药残留水平的评估。草莓样品经乙腈匀浆提取，NH2固相萃取柱净化,以反相C18色谱柱分离，0.1%甲酸-水和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，多反应监测模式进行定量分析。运用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱仪(UPLC-Q-TOF)考察了不同前处理方法的净化效果，研究了草莓样品的基质效应，并以空白草莓样品添加标准溶液的方法确定定量下限。结果表明：19种农药在0.000 5～1.0 mg/L范围内均呈良好的线性关系，相关系数大于0.999；在高、中、低3个加标水平下的平均回收率为77.3% ～100.3%，相对标准偏差(n=5)不大于12.3 %；双炔酰菌胺、联苯肼酯、啶氧菌酯和吡唑醚菌酯的定量下限为0.001 mg/kg，其余均为0.01 mg/kg。该方法简单、快速、灵敏度高，具有良好的抗基质干扰能力，可满足草莓中19种农药残留检测的要求。

超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)；固相萃取(SPE)；农药；残留；草莓

设施草莓(Fragaria ananassa Duchesne)具有栽培容易、管理方便、生产成本低、产量高、收益好等优点，近年来成为各地种植业结构调整的主要内容和农民增收的主要途径。草莓以其柔软多汁、酸甜适度、芳香浓郁、营养丰富等特点，成为广大市民最喜爱、最普遍食用的水果品种。但值得注意的是，目前我国草莓上登记可供选用的农药品种少[1]，大多数农药缺少在草莓上使用的合理建议，亦无安全使用间隔期，从而导致生产中农民凭经验选用农药，随意扩大用药量、随时采摘，这对草莓的质量安全以及消费者健康造成巨大隐患。

当今，世界各国对农产品安全问题非常重视，如美国、日本、欧盟等国家或国际组织均制订了农药在食品和农产品中的最大残留限量(MRL)[2]。日本作为我国农产品的主要出口国家，在2005年“肯定列表制度”实施后，我国出口日本的植物源性农产品中农药超标比例逐渐增加[3]。农药残留问题已经成为国外限制我国农产品出口的新一轮技术壁垒。因此，开发一种简单快速、准确稳定、可用于草莓中多种农药残留量检测的方法，不仅对全面加强草莓中的农药污染监测和监管，保障草莓产业健康发展具有重要意义，还可为我国农产品对外出口提供有力的技术支撑。

目前，针对草莓中农药残留的检测方法有气相色谱法[4-7]、液相色谱法[8]、气相色谱-串联质谱法(GC- MS/MS)[9- 10]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[11-12]、液相色谱-串联飞行时间质谱法[13]、气相色谱-串联飞行时间质谱法[12]等，但气相色谱法和液相色谱法易受杂质干扰，且检测时间较长。液相色谱/气相色谱-串联飞行时间质谱对仪器要求较高、仪器灵敏度低，对大多数残留而言很难实现实验室测定。液相色谱-串联质谱法因具有高分辨、高通量、高灵敏度等特点，成为近年来农药多残留检测技术的主流方向[11-14]。本研究选择19种在草莓实际生产中应用最为广泛的杀虫、杀菌剂进行研究，这些目标化合物中，仅啶虫脒、多菌灵、联苯肼酯、嘧菌环胺、氯虫苯甲酰胺和啶酰菌胺建立了在草莓上的最大残留限量[15]，且其中溴氰虫酰胺等农药并未涵盖在现行的GB/T 27069[16]之中，因此，本方法的建立将对评价草莓中农药残留膳食安全提供有力的技术支持。

本文通过比较不同前处理方法的净化效果，建立了一种利用超高效液相色谱-串联质谱同时测定草莓中19种农药的多残留检测方法。该方法简单、快速，灵敏度与准确度完全满足果蔬中农残检测要求。

1　实验部分

1.1材料与设备

1290超高效液相色谱仪、G6460 三重四极杆质谱仪、6530四极杆-飞行时间质谱仪(美国Agilent公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)；T18 ULTRA-TURRAX高速匀浆机(德国IKA集团)。

19种农药标准品中除虫脲的纯度为97%，其余均为98%。乙腈、甲醇(色谱纯，德国Merck公司)；PSA固相萃取柱(500 mg/6 mL)、NH2固相萃取柱(500 mg/6 mL)、Florisil固相萃取柱(1 000 mg/6 mL)、PC-NH2固相萃取柱(500 mg/6 mL)、商品化QuEChERS净化管(天津艾杰尔公司)；0.22 μm有机相针筒式滤膜(天津艾杰尔公司)；草莓购于当地农贸市场。

1.2标准溶液配制

1.2.1标准储备溶液准确称取适量标准物质，用乙腈稀释成1 000 mg/L的标准储备液，-20 ℃保存，有效期1年。使用时逐级稀释。

1.2.2混合标准溶液准确移取0.5 mL单标储备液(双炔酰菌胺、联苯肼酯、啶氧菌酯和吡唑醚菌酯各吸取0.05 mL)于50 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成10 mg/L的混合标准溶液。4～6 ℃保存，有效期6个月。

1.3样品前处理

1.3.1提取准确称取20 g(精确至0.1 g)样品至250 mL三角瓶中，加40 mL乙腈，在高速匀浆机中匀浆1 min，收集滤液至装有5～7 g NaCl的200 mL具塞量筒中，盖上盖子后，剧烈振荡1 min，室温下静置1 h。取上清液10 mL，于40 ℃水浴条件下氮气吹至近干，残渣用2 mL二氯甲烷-甲醇(95∶5)溶解，待净化。

1.3.2净化NH2固相萃取柱用5 mL二氯甲烷-甲醇(95∶5)活化，再将样品转移至固相萃取柱中，用二氯甲烷-甲醇(95∶5)洗涤样品瓶，每次4 mL，洗涤2次，并将洗涤液全部转入固相萃取柱中，收集全部流出液。将其在40 ℃水浴条件下氮气吹至近干后，用5 mL乙腈复溶，过0.22 μm有机相滤膜，待测。

1.4色谱与质谱条件

色谱柱：Agilent Proshell120 EC-C18柱(100 mm×3.0 mm，2.7 μm)；柱温30 ℃；流速0.4 mL/min；进样量2 μL；以0.1%甲酸水溶液(A相)和乙腈(B相)为流动相。线性梯度洗脱程序：0 ～5 min，5% ～50% B；5 ～7 min，50%～75% B；7 ～8.5 min，75%～80% B；8.5～9 min，80%～95% B；9～13 min,95%B。

电喷雾离子源(ESI)，正离子模式电离；鞘气温度：350 ℃；鞘气流量：12 L/min；雾化气压力：0.28 MPa；毛细管电压：3 000 V(ESI+)；干燥气温度：300 ℃；干燥气流量：7 L/min。采用多反应监测(MRM)方式检测，各化合物的监测离子、碰撞能量、碎裂电压等参数见表1。

2　结果与讨论

2.1仪器条件的优化

2.1.1质谱条件的优化以甲醇-水(50∶50)为流动相，采用单针进样方式，对19种目标农药的质谱条件进行优化，在电喷雾正、负离子模式下进行全扫描，选择合适的准分子离子峰和电离方式。根据化合物的响应，以准分子离子为母离子，进行二级质谱扫描，以两个响应信号稳定的子离子作为定性子离子，其中响应信号较强的子离子作为定量子离子，并优化得到最佳碎裂电压和碰撞能量。最后，结合基质空白溶液和基质标准溶液的离子扫描图，进一步优化参数，确定各农药在MRM模式下的质谱采集参数(见表1)。

表1　MRM监测模式下19种农药的质谱采集参数

*quantification ion

2.1.2色谱条件的优化考察了0.1%甲酸水-甲醇(A)、0.1%甲酸水-乙腈(B)、0.2 mmol/L乙酸铵溶液-甲醇(C)和0.2 mmol/L乙酸铵溶液-乙腈(D)4种流动相体系对19种目标农药的分离效果和离子化效率。结果显示，当流动相为C和D时，茚虫威、除虫脲和多菌灵的仪器响应较低，乙酸铵的加入具有明显的抑制离子化效果；而当使用A和B流动相时，19种目标化合物的响应明显高于C和D流动相时的响应，这与甲酸有利于正离子模式质谱分析的理论相吻合，相对而言乙酸铵则有利于负离子模式的质谱分析。此外，以乙腈作为流动相时，氯虫苯甲酰胺、茚虫威、联苯肼酯、螺螨酯和哒螨灵的仪器响应明显高于甲醇流动相。因此，最终选择0.1%甲酸水-乙腈为流动相。

进一步研究发现，流动相的梯度洗脱对目标农药的色谱峰信号强度有很大影响，如粉唑醇、双炔酰菌胺和啶酰菌胺等大部分农药随着保留时间的延后，响应值有1.5～3倍的增强。原因可能与杂质分离或者电离时溶剂的比例有关。

在优化的梯度洗脱条件下，19种农药能够在12 min内完成分离与检测。优化条件下，空白草莓样品加标的总离子流图见图1。

2.2净化方法的选择

对比了6种净化方式的净化效果。方法1：PSA净化柱，乙腈作为洗脱剂；方法2：Florisil净化柱，乙腈-甲苯(3∶1)作为洗脱剂；方法3：NH2净化柱，二氯甲烷-甲醇(95∶5)作为洗脱剂；方法4：PC-NH2净化柱，二氯甲烷-甲醇(95∶5)作为洗脱剂；方法5：QuEChERS(参照AOAC 2007.01方法)；方法6：Mini-Luke方法[17]。

运用上述6种处理方法净化草莓空白样品，以UPLC-Q-TOF进行一级质谱扫描。结果显示，在目标化合物出峰时间段，净化方法1～4的干扰物明显少于方法5和6。根据分子特征查找化合物发现，按照方法6净化得到的样品中共萃物高达6 042种之多，方法5得到的共萃物也有4 924种，其他4种方法的净化效果相当，共萃物在2 000～3 000种之间。

在此基础上，采用1～4净化方法对19种目标农药在草莓样品中进行加标浓度为0.01 mg/kg的回收率实验。结果表明，方法1和3可使90%以上的目标农药得到满意的回收率；而方法2和4则只有70%目标农药的回收率在70%以上，其中以吡蚜酮差别尤为明显，在用Florisil柱或PC-NH2柱净化时，回收率为零，而用PSA柱或NH2柱净化时，回收率则均在70%以上。此外，相比方法3而言，方法1的成本较高，洗脱剂的毒性较大，因此，实验最终选择NH2柱作为固相萃取柱，采用二氯甲烷和甲醇(95∶5)为洗脱剂进行样品前处理，此时方法的背景干扰最小，有利于保护仪器，减少共萃物对目标农药的电离影响，同时环境成本和耗材成本最低。

2.3方法评价

2.3.1基质效应的影响基质效应是指从样品中与目标物同时提取出的共萃物对目标物分析产生的影响和干扰，包括基质增强效应和基质减弱效应。在LC-MS/MS检测过程中，基质减弱效应更为常见，这与离子的抑制作用有关[18]。基质效应通常与基质种类、目标分析物的特性、色谱分离条件等有关，可按照下式[19]进行量化评估：

弱基质效应(|Mi|<20%)时，无需采取补偿措施，而中等程度基质效应(20% ≤|Mi|≤50%)或强基质效应(|Mi|>50%)时，必须采取补偿措施[20]，通常采用基质匹配标准溶液校正法和样品稀释法。

按照“1.3”进行前处理，“1.2”配制的混合标准溶液用基质空白溶液稀释至0.1 mg/L,并用乙腈配制同浓度的纯溶剂标准溶液，按上述公式进行基质效应的量化评估，结果见表2。在草莓基质中，哒螨灵和螺螨酯显示中等基质减弱效应(Mi分别为-33.4%和-23.1%)，其他17种目标农药均为弱基质效应。这说明使用NH2固相萃取柱和合适的洗脱剂比例，使得极性共萃物洗脱的可能性大大降低。

2.3.2线性范围、准确度及精密度配制一系列不同浓度的基质匹配标准溶液，优化条件下进行处理，以加标回收的方法确定化合物的定量下限(LOQ)。结果显示，双炔酰菌胺、联苯肼酯、啶氧菌酯和吡唑醚菌酯的LOQ为0.001 mg/kg，其余15种农药为0.01 mg/kg。在0.000 5～1.0 mg/L范围内，19种目标农药基质匹配标准溶液的浓度与对应峰面积呈良好的线性关系，相关系数(r2)均大于0.999。以实际进样时标准溶液能够出峰的最小浓度计算检出限(LOD)，结果见表2。

表2　草莓中19种农药的检出限、线性范围、平均回收率、相对标准偏差及基质效应

通过加标回收实验，评价本方法的准确度和精密度。结果显示，在高、中、低3个不同加标浓度下，平行5次实验，19种目标化合物的平均回收率为77.3% ～100.3%，相对标准偏差(RSD)为1.5%～12.3%(见表2)，表明方法具有良好的准确度与精密度。

2.4方法的应用

采用本方法对采自上海郊区农贸市场的50个草莓样品进行检测，结果如表3所示。其中检出多菌灵、啶虫脒、氯虫苯甲酰胺、啶酰菌胺、联苯肼酯、氟硅唑、吡唑醚菌酯、吡虫啉、哒螨灵和茚虫威共10种农药。参照GB2763-2014《食品中最大残留限量标准》[15]，其残留均未超出最大限量(MRL)。

表3　草莓样品中农药的残留情况

-：not formulated(未制定) ;*temporary maximum residue limits(临时最大残留限量);ND：not detected(未检出)

3　结　论

本文建立了同时测定草莓中19种农药的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)方法，该法的线性关系良好，适用性和可操作性强，定量下限低于目前国内外的最大残留限量要求，符合残留检测要求，可用于草莓中农药残留水平的评估。

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Determination of 19 Pesticides Residues in Strawberries by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

MA Lin1,HUANG Lan-qi1,CHEN Jian-bo1,YIN Jun2,ZHAN Xiu-ping1,ZHAO Li*

(1.The Ministry of Agriculture Pesticide Quality Supervision and Inspection Testing Center(Shanghai)，Shanghai Agriculture Technology Extension & Service Centre,Shanghai201103,China;2.Shanghai Municipal Agriculture Technology Extension & Service Centre,Shanghai2012021,China )

A solid phase exaction coupled with ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(UPLC-MS/MS) method was developed for the simultaneous determination of 19 pesticides in strawberry.After extraction with acetonitrile,purification with NH2SPE cartridges and dissolution with methanol,the analytes were analyzed by UPLC-MS/MS on an Agilent Proshell120 EC-C18column with a mixture of 0.1% formic acid-acetonitrile as mobile phase by gradient elution.The mass spectrometer was operated in multiple reactions monitoring(MRM) mode in positive mode.The purifying effects of 6 pretreatment methods were optimized by UPLC-Q-TOF.Matrix effects of real strawberries were studied.The limits of quantitation(LOQs),which were determined by adding standard solution to pesticide-free strawberry samples,were 0.001 mg/kg for mandipropamid,bifenazate,picoxystrobin and pyraclostrobin and 0.01 mg/kg for the others.Good linearities were obtained for 19 pesticides in the concentration range of 0.000 5-1.0 mg/L with correlation coefficients more than 0.999.The fortified recoveries at low,intermediate and high concentration levels were in the range of 77.3%-100.3%,with relative standard deviations(RSDs) not more than 12.3%.False positive results were avoided effectively due to the method’s good ablity of resistence matrix interference.All the above observations indicated that the established method was simple,efficient and sensitive,and was suitable for the determination of 19 pesticides in strawberry.

ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);solid phase extraction(SPE);pesticides;residue;strawberry

2015-11-10；

2015-12-16

上海市农委科技攻关项目(沪农科攻字(2013)第3-2号)

赵莉，硕士，高级农艺师，研究方向：农产品安全监管，Tel：021-64052181，E-mail：zhaoli5741@aliyun.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.011

O657.65;F767.2

A

1004-4957(2016)06-0698-06