基于QuEChERS提取的HPLC-MS/MS法测定禽肉中的利巴韦林与金刚烷胺

郭礼强，孙　军，田国宁，张金玲，王梅玲，李　凯

(潍坊出入境检验检疫局，山东　潍坊　261041)



基于QuEChERS提取的HPLC-MS/MS法测定禽肉中的利巴韦林与金刚烷胺

郭礼强*，孙军，田国宁，张金玲，王梅玲，李凯

(潍坊出入境检验检疫局，山东潍坊261041)

建立了液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)同时测定禽肉中利巴韦林和金刚烷胺的检测方法。禽肉样品用1%(体积分数)三氯乙酸水溶液-甲醇(1∶1,体积比)提取，经PCX固相萃取柱和QuEChERS方法净化后，以含5 mmol/L乙酸铵水溶液与甲醇为流动相梯度洗脱，BEH HILIC(2.1 mm×100 mm,1.7 μm) 色谱柱分离，电喷雾正离子模式电离，多级反应监测(MRM)模式进行检测，内标法定量。结果表明，利巴韦林和金刚烷胺在0.50～200 μg/L范围内呈良好线性，相关系数均大于0.997。两种目标分析物的方法检出限(S/N≥3)分别为0.30 μg/kg和0.15 μg/kg，定量下限(S/N≥10)分别为1.00 μg/kg和0.50 μg/kg，样品在其1倍、2倍、10倍定量下限3个加标水平下的日内回收率为92.5%～104.7%，相对标准偏差(RSD)为3.4%～7.8%；日间回收率为93.3%～106.0%，RSD为6.0%～10.7%。该方法灵敏、简便、准确，可用于禽肉中利巴韦林和金刚烷胺残留的同时检测。

分散固相萃取；利巴韦林；金刚烷胺；液相色谱-串联质谱；禽肉

2012年12月，央视曝光养殖企业违规向白羽鸡饲料中添加利巴韦林、金刚烷胺等抗病毒药物，从而引起消费者对“速生鸡”事件的广泛关注。利巴韦林易产生耐药性，对人体的最突出安全性问题是溶血性贫血及动物实验显示的遗传毒性、生殖毒性和致癌性等[1]。金刚烷胺也有致畸性，可导致精神病患者精神分裂症状加重，并出现难治性双下肢水肿[2]。禽畜滥用抗病毒药物不仅会造成禽畜肉质风味的下降，且会导致禽畜肉中大量的药物残留，进而通过食物链危害人类健康。农业部在2005年发布了《关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知》，明确规定禁止利巴韦林、金刚烷胺等抗病毒兽药的销售和使用。

目前，检测利巴韦林和金刚烷胺的方法主要有液相色谱法[3-7]和液相色谱-串联质谱法[8-14](LC-MS/MS)，液相色谱法灵敏度偏低，受基质干扰影响大，不能满足食品安全中关于禽肉中抗病毒药物残留的检测需求；液相色谱-串联质谱法可提供检测化合物的结构信息，具有高通量和高选择性，可以同时检测两种目标分析物。由于禽肉样品中残留的抗病毒药物含量少，基质干扰多，亟需建立可行的前处理技术以及灵敏度高的检测方法。本研究选择鸡鸭养殖中常见抗病毒兽药利巴韦林和金刚烷胺为研究对象，结合QuEChERS和SPE柱净化前处理提取方法，建立了禽肉中利巴韦林和金刚烷胺的快速LC-MS/MS测定方法。该方法可操作性强，检测周期短，为企业和食品安全监管部门提供了有效的技术支撑。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

高效液相色谱-串联质谱联用仪：Agilent 1290-6430(美国Agilent公司)，配电喷雾离子源(ESI)；5810R型离心机(德国Eppendorf公司)；N-EVAP氮吹仪(美国Organomation Associates公司)；Milli-Q纯水机(美国Millipore公司)；KQ-500型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Cleanert PCX-SPE净化柱(天津博纳艾杰尔公司)；利巴韦林专用柱(Poroshell 120,2.1 mm×150 mm，2.7 μm)和C18柱(Eclipse Plus C18，3.0 mm×100 mm，1.8 μm)购于美国Agilent公司；ACQUITY UPLC BEH HILLIC柱(HILLIC,2.1 mm×100 mm，1.7 μm)购于美国Waters公司。

利巴韦林(Ribavirin)和金刚烷胺(Amantadine)购于德国Sigma公司；利巴韦林内标(Ribavirin-13C5)购于上海安谱公司；金刚烷胺内标(Amantadine-D15)购于德国Dr.Ehrenstorfer公司；中性氧化铝(Alumina-N，100～200目)购于天津市科密欧公司；石墨炭黑粉(GCB，120～400目)、C18粉(ODS，50 μm)、PSA粉(PSA，40～60 μm)、氨丙基粉(NH2，40～60 μm)购于Agela technologies inc公司；乙腈和甲酸均为色谱纯，购于美国Biopure公司；实验用水为超纯水。

1.2溶液的配制

标准工作液：准确移取两种待测物标准品1 mL于100 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，混匀，配成终浓度为1 μg/mL的标准工作溶液。同法配成利巴韦林和金刚烷胺内标工作液为1 μg/mL。

混合标准工作液：移取10 mL利巴韦林和5 mL金刚烷胺标准中间液置于100 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，混匀，配成利巴韦林和金刚烷胺的浓度分别为100 ng/mL和50 ng/mL。同法配成利巴韦林和金刚烷胺内标浓度分别为100 ng/mL和50 ng/mL。

提取液：称取三氯乙酸1.0 g置于500 mL烧杯中，依次加入100 mL水和100 mL甲醇，搅拌均匀。

洗脱溶液：5 mL氨水、25 mL异丙醇和70 mL甲醇混合均匀。

定容液：30 mL水和70 mL甲醇混合均匀。

1.3色谱条件

色谱柱：BEH HILIC(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；流动相：A为5 mmol/L乙酸铵水溶液，B为甲醇；梯度洗脱程序：0 ～3.0 min，75%～30%B；3.0 ～3.01 min，30% ～75%B；3.01 ～5.0 min，75%B；流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样体积：10 μL。

1.4质谱条件

对海外发行的重视是岭南报刊的重要特色，这一传播格局的基础是数量众多的华侨。岭南是中国移民最早的地区，19世纪资本主义扩张对劳动力的需求，出现了移民潮，移民地区主要是“美洲、大洋洲、非洲和东南亚的一些国家”。[12]东南亚许多国家中粤籍都在华侨中占多数，[13]其他地区，如南美地区，“古巴华侨几乎全是广东省人，其中台山县的约占百分之四十”。[14]

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多级反应监测(MRM)；气帘气压力：35 psi；离子电压：5 500 V；碰撞气：氮气；干燥气温度：550 ℃；喷雾气(GS1)压力：55 psi，辅助雾化气(GS2)压力：55 psi；2种化合物及其内标的质谱检测参数见表1。

表1　利巴韦林和金刚烷胺的部分质谱参数

*quantitative ion

1.5样品处理

准确称取(4±0.01) g绞碎均匀的样品(鸡肉或鸭肉)，置于100 mL具塞离心管内，依次加入内标工作液80 μL和提取液20 mL，均质1 min，以10 000 r/min离心10 min，经脱脂棉过滤，将上清液全部转移至PCX净化柱(预先用3 mL甲醇和3 mL水活化)，再用3 mL 0.1%甲酸水和3 mL甲醇淋洗小柱，真空抽干后，加入6 mL洗脱液，收集洗脱液于10 mL干净玻璃试管中氮气吹干，在玻璃管中加入50 mg Alumina-N，100 mg NH2和1 mL定容液，于涡旋振荡器上振荡1 min，过0.22 μm双系滤膜，供LC-MS/MS分析测定。

2　结果与讨论

2.1色谱条件的优化

色谱流动相常用的有机溶剂有甲醇[8]和乙腈[11-12]，本文考察了此两种有机溶剂对目标物分析的影响，发现当流动相中的有机溶剂由乙腈改成甲醇时，两种目标分析物的响应值均提高了2倍以上，与文献[8]结论相同。同时考察了C18柱、HILIC柱和利巴韦林专用柱对两种目标分析物的影响，结果发现使用C18柱分离时两种目标分析物的响应值不足HILIC柱的1/5，使用利巴韦林专用柱时利巴韦林的峰响应值和HILIC柱差异不明显，但金刚烷胺的响应值偏低且出现双峰，而HILIC柱对两种目标分析物均可良好分离，响应值最好。实验发现，水相中添加甲酸或乙酸铵均能提高目标分析物的响应值，但添加甲酸时利巴韦林的峰形偏宽，添加乙酸铵时两种目标分析物能有效分离，峰形好，而在水相中同时添加甲酸和乙酸铵时，两种目标分析物的响应值反而略有降低。考察不同浓度乙酸铵溶液对两种目标分析物的影响，选择5 mmol/L乙酸铵水溶液为水相，此时目标分析物的响应值和峰形最佳，同时提高柱温为40 ℃，调整流动相比例，以进一步提高色谱的灵敏度和稳定性。

2.2质谱条件的优化

利巴韦林和金刚烷胺在正离子模式下的响应值较高[8,11-12]。首先将500 μg/L的混合标准溶液分别通过自动进样泵以5 μL进样量直接注入ESI离子源，通过正离子扫描，找到目标分析物各自的准分子离子峰[M+H]+后，再分别优化其质谱参数，得到碎片离子信息，优化的MRM质谱参数见表1。图1为利巴韦林和金刚烷胺混合标准溶液(1 μg/L)在MRM模式下的色谱图。

2.3提取条件的优化

利巴韦林和金刚烷胺均属于极性化合物，在有机溶剂中溶解度很小，一般选用有机溶剂-水[8,11]的混合溶液提取。考察了乙腈-水(1∶1，体积比)和甲醇-水(1∶1，体积比)对目标分析物回收率的影响，结果显示甲醇-水作为提取液时回收率比乙腈-水高30%。进一步考察了加酸对回收率的影响，在甲醇-水中添加不同比例的甲酸、乙酸和三氯乙酸，发现添加甲酸对回收率的影响不大，添加乙酸和三氯乙酸会使回收率由51.3%分别提高到61.2%和65.1%，考虑到三氯乙酸有沉淀蛋白的作用，起到一定的净化效果，可以提高方法的灵敏度，最终选用甲醇-1%三氯乙酸水溶液(1∶1)作为提取溶剂。

2.4净化方式的选择

直接采用提取液提取禽肉中的利巴韦林和金刚烷胺时，发现样品中的脂肪、蛋白质等干扰目标分析物的检测，尤其是利巴韦林在低浓度时受基质影响比较严重。考察了常用的固相萃取柱PBA柱[1，11-12]、SCX柱[8]、C18柱[14]和PCX柱对目标物的净化效果。结果显示，C18柱对目标分析物无保留，PBA柱、SCX柱和PCX柱均可保留目标物，且SCX柱和PCX柱的保留效果高于PBA柱。由于SCX柱和PCX柱的材料相似，对两种目标物的回收率无明显差异，考虑到PCX柱的性价比更好，最终选择该柱进行考察。实验中还发现一些带皮的样品(如烟熏去骨整鸭、冻鸭肉等)，用PCX柱净化时基质影响仍比较严重，本文结合QuEChERS[15-16]方法，进一步考察了Alumina-N，GCB，ODS，PSA，NH25种净化粉对利巴韦林和金刚烷胺的吸附回收率，通过标准品加净化粉经质谱检测并计算回收率，结果发现Alumina-N净化的回收率为75.3%～84.5%，NH2净化的回收率为70.0%～87.6%，两种净化粉的回收率较好；而ODS，GCB和PSA对目标分析物的吸附非常严重，导致回收率偏低(回收率为22.6%～64.5%)。Alumina-N粉末具有粒径小、表面积大、吸附性能强的优点，能吸附肉类基质中的多种杂质特别是含硫化合物。NH2具有比PSA相对较弱的阴离子交换能力，可与一定的有机酸、色素以及糖类发生离子交换作用。通过对比PCX柱结合两种净化粉不同添加比例组合对目标分析物的净化效果，确定最佳比例条件如“1.5”所示。

2.5标准曲线及检出限

在优化条件下，对两种目标分析物质量浓度在0.50～200 μg/L之间的系列混合标准溶液进行测定，以各化合物定量离子与内标校正离子峰面积之比的平均值(Y)对其质量浓度(X，μg/L)绘制标准曲线。结果显示利巴韦林和金刚烷胺在0.50～200 μg/L范围内呈良好线性；相关系数(r)分别为0.998 2和0.997 8。在禽肉中添加系列浓度的混合标准物质，以信噪比(S/N)为3作为方法的检出限(LOD)，以S/N=10作为方法的定量下限(LOQ)。利巴韦林和金刚烷胺的LOD分别为0.30 μg/kg和0.15 μg/kg，LOQ分别为1.00 μg/kg和0.50 μg/kg。

2.6样品基质的影响

电喷雾离子化效率受样品基质的影响较大。本研究用抑制率评价样品基质对目标分析物的抑制作用，即基质空白中添加标准品的监控离子响应强度与有机溶剂中添加标准品的相应监控离子响应强度减少的百分比。以不含目标分析物的鸡肉和鸭肉为基质空白，分别添加定量下限浓度水平的利巴韦林和金刚烷胺标准溶液，与相应标准溶液进行比较。结果表明，样品基质对两种目标分析物有一定的抑制作用，但不同基质对两种目标分析物的抑制率相差不大，利巴韦林的平均抑制率为18.2%，金刚烷胺为14.3%。为消除基质对检测的影响，同时有效评估提取和净化方法的损失，保证方法的通用性和适用性，本方法以内标法定量，可同时消除不同因素对测定结果的影响。

2.7回收率与精密度

在空白样品中添加利巴韦林和金刚烷胺定量下限1倍、2倍、10倍3个水平的混合标准物质进行加标回收实验，按“1.5”方法进行样品预处理，日内每个浓度平行测定6个样品，连续测定3 d。结果表明，两种目标分析物的日内回收率为92.5%～104.7%，相对标准偏差(RSD)为3.4%～7.8%；日间回收率为93.3%～106.0%，RSD为6.0%～10.7%(见表2)。

表2　方法的加标平均回收率与相对标准偏差

2.8实际样品的测定

日本对我国禽肉中利巴韦林残留的出口限量为10.0 μg/kg，金刚烷胺限量为2.0 μg/kg。采用本方法对从出口企业抽检的60份鸡肉或鸭肉样品中的利巴韦林和金刚烷胺进行测定，1份烟熏鸭胸肉中金刚烷胺的残留量超出了日本的限量标准，其含量为5.9 μg/kg。表明方法可用于实际样品的检测。

3　结　论

本文基于PCX净化柱和QuEChERS粉净化的前处理技术，建立了一种结合超高效液相色谱-串联质谱快速测定禽肉中利巴韦林和金刚烷胺的方法，能够实现对两种目标分析物的同时定性、定量分析。该方法具有灵敏、准确、实用性强等优点，可满足禽肉中利巴韦林和金刚烷胺的检测要求，为禽肉中抗病毒药物残留的综合风险分析提供了技术支持。

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Determination of Ribavirin and Amantadine in Poultry Meat by QuEChERS-based Extraction with Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

GUO Li-qiang*,SUN Jun,TIAN Guo-ning,ZHANG Jin-ling,WANG Mei-ling,LI Kai

(Weifang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Weifang261041,China)

A method was developed for the simultaneous determination and identification of ribavirin and amantadine residues in poultry meat by liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).The samples were purified with solid phase extraction column of PCX and QuEChERS method after extraction with 1% trichloroacetic acid-methanol(1∶1),then separated on a BEH HILIC column(2.1 mm×100 mm,1.7 μm) by gradient elution with mobile phases of 5 mmol/L ammonium acetate-methanol.An internal standard method was used for quantitative analysis.The electrospray was operated in positive mode and a multiple reaction monitoring(MRM) as survey scan.The results showed that the calibration curves were linear in the range of 0.50-200 μg/L for two analytes with correlation coefficients(r) more than 0.997.The limits of detection(LODs,S/N≥ 3) for ribavirin and amantadine were 0.30 μg/kg and 0.15 μg/kg,respectively,and the limits of quantitation(LOQs,S/N≥ 10) were 1.00 μg/kg and 0.50 μg/kg,respectively.On the basis of LOQs,the intra-day average recoveries for two analytes in poultry meat samples at three spiked levels(1,2,10 times LOQ) ranged from 92.5% to 104.7% with relative standard deviations(RSDs) of 3.4%-7.8%,while the inter-day average recoveries ranged from 93.3% to 106.0% with RSDs of 6.0%-10.7%.The method was sensitive,convenient and accurate,and could satisfy the demands for detection of ribavirin and amantadine residues in poulrty meat.

dispersive solid phase extraction;ribavirin;amantadine;liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS);poultry meat

2015-12-06；

2015-12-27

潍坊市2015年科学技术发展计划(2015ZJ1101)；山东出入境检验检疫局科研基金(SK201349)

郭礼强，硕士，工程师，研究方向：农药和兽药残留检测，Tel：0536-8582561，E-mail：glq1980@sina.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.019

O657.63;TQ460.7

A

1004-4957(2016)06-0739-05