基于准确质量数对肽族[γ-(Glu-Cys)n-Gly]色谱-质谱分析研究

李景喜，赵金泉，尹晓斐，孙承君，陈军辉，郑　立，王小如

(1.国家海洋局　第一海洋研究所　海洋生态研究中心，山东　青岛　266061；2.青岛大学公共卫生学院，山东　青岛　266021)



基于准确质量数对肽族[γ-(Glu-Cys)n-Gly]色谱-质谱分析研究

李景喜1*，赵金泉1,2，尹晓斐1，孙承君1，陈军辉1，郑立1，王小如1

(1.国家海洋局第一海洋研究所海洋生态研究中心，山东青岛266061；2.青岛大学公共卫生学院，山东青岛266021)

基于多肽γ-(Glu-Cys)n-Gly系列化合物合成的递增规律性，利用Trap-MS离子筛选功能实现多肽的定性定量分析。首先利用多肽分子中巯基与单溴二胺(mBBr)发生缩合反应，生成具有荧光信号的多肽衍生物，比较衍生化前后分子量发现多肽与mBBr的反应比例为1∶1，荧光信号强度1周内稳定性较好。优化了色谱分离及质谱条件，建立了HPLC-Trap-MS定性定量分析方法，离子提取结果显示:多肽化合物基于其理论分子量定性分析准确快速，化合物分离效果明显，PC2,PC3,PC4,PC5和PC6系列标准溶液的线性范围宽，相关系数(r)大于0.999，各化合物的方法检出限分别为0.13，0.02，0.17，0.39，0.82 mg/L，化合物的回收率为89.0%～99.5%；相对标准偏差(RSD)小于3.5%；多肽化合物的荧光标记和Trap-MS筛选可实现荧光与质谱双重检测器的定量分析，该方法可对多肽系列化合物进行快速、准确的测定。检测了Zn和Cd诱导后藻体中多肽的含量变化，结果显示藻体中的多肽对金属具有诱导响应，其中小分子肽变化相对明显，随着碳链的增加，多肽对重金属的诱导响应滞后。

多肽；荧光标记；高效液相色谱；质谱表征；离子提取

多肽化合物(Phytochelatins，PCs)是由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸组成的多肽，其分子量范围为2～4 kDa，化学通式为(γ-Glu-Cys)n-Gly(n=2～11)[1-2]。PCs是特殊的金属巯蛋白，广泛分布于植物体内，但PCs不是结构基因的直接产物，而是在重金属离子刺激下，以GSH为底物合成的酶促产物[3-5]。植物体内PCs化合物的存在可以提高其对重金属元素的耐性和降低重金属对植物体本身的毒害作用，当金属离子在植物体内积累量较高时，PCs可使得金属离子排出[6-7]，另外，植物体内的PCs还具有维持和调节金属离子平衡以及抗氧化等功能[8-12]。

多肽PCs在生物修复重金属污染环境中的应用前景已引起人们的关注，PCs在环境重金属污染监测和生态恢复方面具有较大的应用潜力。Gawei等[13]认为，多肽PCs可作为工业区森林退化的判断依据，通过分析试验区树木中PCs的浓度，发现重金属胁迫是森林退化的重要原因，并且树木体内PCs含量与森林衰败率之间具有很高的相关性[14]。目前，随着海洋环境中污染物分析的痕量化、多样化，蛋白及多肽技术为海洋污染提供了新的思路和技术支持，蛋白及多肽组学技术对于低浓度、低胁迫、多应激反应机制诱导有新的突破[15-16]。其中，海藻在重金属胁迫下的抗逆性研究是环境科学研究的重点和热点之一，由于海藻体内多肽的含量与海洋环境中重金属浓度有一定相关性，能作为海洋环境中污染物暴露和毒性效应早期预警的有效生物标志物，可广泛用于海洋污染的监测[17-18]，因此，研究海藻中多肽对重金属的诱导响应，可为海洋环境监测和评价提供基础理论和技术支撑，建立多肽化合物的准确定性定量分析方法是研究多肽化合物的关键之一。

据近年来的文献报道[19-20]，测定PCs的方法主要包括高效液相色谱法、电化学法、电泳法等[21-22]，但多数集中在小肽化合物分析，关于多肽系列化合物的分析较少，特别是海藻中多肽检测的研究报道甚少。本研究基于多肽PC2～PC6中的富有巯基(—SH)官能团与单溴二胺(mBBr)衍生化反应，生成具有荧光特性衍生物，衍生化后的多肽巯基可被保护；对衍生化后的多肽化合物利用HPLC-Trap-MS进行测定，利用质谱离子提取功能并基于多肽分子量进行定性分析，通过各化合物的离子强度实现定量测定，建立了一种多肽系列化合物快速筛选、准确测定的方法。该法弥补了多种多肽化合物缺少标准品或研制成本高的弊端(如PCn，n≥7)，适用于复杂基质中多肽的定性测定；衍生物的荧光标记和荧光强度稳定，可实现多肽的荧光和质谱(HPLC-Trap-MS)联机双重检测器同时定量检测，提高多肽化合物定量测定的准确度；另外，研究通过重金属诱导，初步探索了多肽化合物PC2～PC6对重金属的诱导响应，研究了多肽间对单一和双金属诱导响应差异性，为进一步深入研究藻体中多肽化合物对环境中重金属的诱导机制奠定了基础。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

高效液相色谱仪(Agilent 1200)，配有荧光检测器；离子阱质谱仪(Agilent Ion Trap LC-MS 6320)，配有电喷雾(ESI)离子源；冷冻干燥机(德国 Christ ALPHA 1-4 LSC)；电子天平、高速万能粉碎机等。

单溴二胺(mBBr,>95%)、甲磺酸(MSA，>99%)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA，>99%)为Fluka公司产品；PC2，PC3，PC4，PC5和PC6标准品(纯度≥95%，ANASPEC公司)；N-(2-羟乙基)哌嗪-N-3-丙磺酸(HEPPS，>99.5%)和三氟乙酸(TFA，99%)购于上海信裕生物科技有限公司；乙腈(色谱纯,Lab-Scan)；超纯水(18.2 MΩ·cm)。

1.2实验方法

1.2.1标准品的配制采用0.1% TFA(含6.3 mmol/L DTPA)水溶液配制1 g/L PC2，PC3，PC4，PC5和PC6的储备液，4 ℃保存。用0.1%TFA(含6.3 mmol/L DTPA)稀释多肽储备液，配制GSH，PC2，PC3，PC4，PC5和PC6的混合标准溶液系列，各化合物的浓度范围为0.1～100 mg/L。标准品配制完成后立即进行柱前衍生化反应。

mBBr用100%乙腈配成25 mmol/L，振荡混匀，4 ℃避光保存，现配现用。

1.2.2色谱-质谱条件色谱柱:Zorbax SB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；柱温26 ℃；荧光检测器条件:激发波长为380 nm，发射波长为470 nm；流动相:A为含0.1% TFA的水溶液，B为100%乙腈；梯度洗脱∶12%～21%B(13 min)，21%B(7 min)，21%～23%B(5 min)，23%～25%B(5 min)，25%～100%(10 min)，100%～12%(2 min)；100%B洗柱(5 min)。流速0.5 mL/min；进样量20 μL。

质谱扫描模式:正离子模式；干燥器温度:350 ℃；干燥气体流速:10 L/min；雾化气压力:25 psi；毛细管电压:4 500 V；裂解电压:120 V。

1.2.3衍生化反应衍生化反应:取250 μL多肽标准(或样品)溶液，加入450 μL浓度为 200 mmol/L的 HEPPS(含6.3 mol/L DTPA，pH 8.2)溶液，充分混匀，常温避光温育10 min，加入10 μL 25 mmol/L的 mBBr溶液，充分混匀，45 ℃避光反应30 min后，加入300 μL 1 mol/L的 MSA旋涡振荡摇匀，终止反应。同时作试剂衍生化空白；反应液于4 ℃避光保存，直至分析测定。

2　结果与讨论

2.1多肽合成机理与分子量鉴定

多肽化合物是由植物螯合肽合成酶(γ-谷氨酰半胱氨酸二肽基转肽酶)催化合成，合成过程为:多肽合成酶的结构中C端有信号检测域，N端有激活域，当没有金属离子(如Cd2+和Zn2+等)存在的条件下，检测域(C端)没有触发信号，致使激活域(N端)无酶活性；当有金属离子存在时，信号检测域(C端)会感应到其信号，此时多肽酶与金属离子、Cys结合，致使激活域(N端)有催化活性；在激活域(N端)，一分子的GSH在多肽合成酶催化作用下与另一个GSH分子合成PC2化合物，PC2再与1个GSH结合相继生成PC3，这一过程不断重复直至反应生成多肽PCn+1系列化合物。因此，多肽化合物具有一定分子通式，分子式为γ-(Glu-Cys)n-Gly，其中n=2～12，通过计算可以获得多肽的理论分子量，如表1所示。

表1　多肽化合物分子量测定

多肽PCs富含多个巯基，利用mBBr分子中Br原子与多肽分子中巯基进行缩合反应，衍生化生成具有一定荧光强度的多肽衍生物；取PC2,PC3,PC4,PC5和PC6标准溶液，加入mBBr进行衍生化反应，利用HPLC-Trap-MS联用测定每种衍生产物的分子量，同时，直接测定PC2,PC3,PC4,PC5和PC6化合物衍生前的分子量；通过比对标记前后PCs及其衍生物的分子量(表1)发现，利用Trap-MS方法测定多肽的分子量较为准确，误差约在±1范围内，计算各衍生产物与各PCs的分子量差，其值为190.0±0.2，此差值与一分子mBBr脱去Br原子后的分子量相吻合(mBBr的理论分子量为271.0),说明多肽与mBBr遵循1∶1反应比例关系。

2.2mBBr标记多肽稳定性

多肽衍生化反应比例具有稳定性，为了考察荧光试剂用量对衍生物荧光信号的影响，移取50 μL 5 g/L的PC2，PC3，PC4，PC5及PC6单一标准溶液，固定多肽化合物量，分别加入5，10，20，50 μL的 25 mmol/L mBBr进行衍生化反应，不同时间内测定衍生物的荧光信号。结果发现(以PC3为例)，多肽衍生物一周之内的荧光信号强度稳定，并且化合物间的相对含量对化合物无影响，过量的mBBr会稍微影响衍生物的荧光强度，因此选择10 μL衍生剂进行实验。

2.3多肽的质谱定性定量分析

2.3.1HPLC-Trap-MS的多肽筛选定性分析以海带浆液作为基体背景，加入多肽化合物后用mBBr标记衍生化反应，优化色谱分离条件。图1为Trap-MS测定样品的总离子流图，谱图显示化合物的吸收峰较多，为了验证离子提取法定性分析的可行性，利用质谱附带软件，基于多肽衍生物的理论分子量进行离子提取，结果如图2所示。在不同的出峰时间出现相应的PCs化合物，通过选择离子谱图可见化合物间的分离效果较好，因此，基于多肽的理论分子量能够实现多肽化合物的定性分析。

2.3.2多肽的定量分析配制PC2，PC3，PC4，PC5和PC6化合物混合标准溶液系列，浓度范围为0～100 mg/L。多肽化合物衍生化反应后，HPLC-Trap-MS进行测定，质谱离子提取软件确定各化合物并计算各组分的峰面积，以峰面积为纵坐标(y)，浓度为横坐标(x，mg/L)绘制标准曲线。同时，以仪器信噪比S/N=3确定各成分的检出限(表2)。结果显示，PC2，PC3，PC4，PC5和PC65种物质的浓度与峰面积均具有良好的相关性，相关系数(r)均达到0.999以上，方法检出限为0.02～0.82 mg/L。

表2　5种化合物的线性范围、线性方程、相关系数及检出限

配制浓度为10 mg/L的多肽混合溶液，通过衍生化反应后，利用本方法重复测定6次，考察方法的准确度及精密度，并将测定结果与溶液浓度标准值进行比较。结果显示。PCs各组分的回收率为89.0%～99.5%，相对标准偏差(RSD)均小于3.5%，表明该方法能够实现PCs化合物的定量分析。其他多肽PCn(n≥7)化合物在生物体内的含量较低，目前缺少相应的标准品，且该组分化合物标准品的研发成本较高，利用本文建立的离子提取定性定量分析方法能够实现高分子多肽的半定量分析，可为多肽在生物体中的作用研究提供技术支撑。

2.4多肽化合物随重金属诱导的变化趋势

2.4.1单元素Zn与Cd诱导藻体内多肽测定了利用0.1 mmol/L的ZnCl2和CdCl2单元素诱导后海带中多肽的含量，考察了海带中多肽化合物对Zn和Cd的诱导响应(表3)。从表中数据可以看出，诱导后藻体中多肽化合物PC2～PC6的浓度存在一定的差异性，浓度达到mg/g数量级，经过Zn和Cd元素诱导后，多肽化合物的浓度变化范围较小，PC2，PC3和PC4含量呈增加趋势，其中PC3浓度变化幅度最大，Zn诱导后藻体中PC3的含量最大差值约0.59 mg/g，Cd诱导PC3的含量最大差值为0.19 mg/g，从变化趋势可看出，PC3和PC4的变化稍微滞后。

表3海带中PCs含量随Zn,Cd诱导时间的变化规律

Table 3The variation of PCs induced by Zn and Cdw/(mg·g-1)

2.4.2Zn与Cd共同诱导多肽通过0.1 mmol/L ZnCl2和0.1 mmol/L CdCl2协同诱导海带，考察了多元素诱导过程中藻体内多肽化合物的变化趋势(表3)。结果发现相同浓度的Zn和Cd共同诱导海藻后，海藻中多肽化合物的浓度变化趋势相对复杂，PC2，PC3和PC4的含量呈稍微增加趋势，但变化规律不明显，PC5和PC6的浓度也稍有变化，但趋势不显著。多肽对多元重金属的诱导响应变化趋势还需获得批量的诱导数据，利用统计学方法统计，进一步探索多肽化合物在重金属诱导过程中的响应，该工作也是今后重金属诱导和多肽响应机制的研究重点和难点之一。

3　结　论

多肽化合物的分子结构具有递增规律性，且多肽富含巯基，本研究利用单溴二胺(mBBr)进行荧光标记，由于肽链上基团存在空间位阻作用，多个巯基不能和mBBr发生缩合反应，致使多肽和mBBr反应比例为1∶1，短期荧光强度测定结果显示衍生物的稳定性较好；Trap-MS测定多肽化合物分子量的方法精确度较高，分子量测量误差在±1范围内，通过离子提取能够实现多肽化合物的分离和定性分析，基于各化合物的离子强度定量测定时，其线性较好，检出限较低，该方法可实现多肽在复杂基质条件下的检测。基于mBBr标记多肽生成具有荧光信号的衍生物，HPLC-Trap-MS联机技术可以实现荧光和质谱双重检测器的定量分析，为多肽的准确定量分析提供了新技术；Zn和Cd诱导海藻内多肽生成的过程中，多肽系列化合物呈不同程度的变化趋势，其中小肽组分的响应较快，变化幅度相对较大，随着肽链的增长，多肽的诱导响应滞后，海藻内多肽对多元金属的诱导变化复杂，需进一步进行海藻批量胁迫诱导和统计分析研究。该研究为深入探讨海藻中多肽对重金属的胁迫响应，以及多肽的变化致使海藻对重金属的富集和耐毒性研究提供了理论依据和技术支撑。

[1]Cobbett C S.PlantPhysiol.,2000,123:825-832.

[2]Wang Y Y,Ye Q H,Wang X N.J.JishouUniv.:Nat.Sci.Ed.(王亚琴，叶青华，王小宁.吉首大学学报:自然科学版)，2009,30(2):85-89.

[3]Liu J X，Xu X Q，Qian Y Q，Ju G S,Han L,Sun Z Y.Chin.J.Ecol.(刘俊祥，许新桥，钱永强，巨关升，韩蕾，孙振元.生态学杂志),2013,32(7):1787-1793.

[4]Wu H F,Gong C F,Liu P.J.Environ.Sci.(吴惠芳，龚春风，刘鹏.环境科学学报),2010,30(10):2058-2064.[5]Mellado M,Contreras R A,Gonzalez A,Dennett G,Moenne A.PlantPhysiol.Biochem.,2012,51:102-108.

[6]Pan Y H,Wang H B,Gu Z P,Xiong G H,Yi F.ActaEcol.Sin.(潘义宏，王宏镔，谷兆萍，熊国焕，易锋.生态学报),2010,30(23):6430-6441.

[7]Lu H,Liu Z P,Zhao B Y.Prog.Vet.Med.(路浩,刘宗平,赵宝玉.动物医学进展),2009,30(1):62-65.

[8]Gonzalez-Mendoza D,Quiroz-Moreno A,Zapata-Perez O.Aquat.Toxicol.,2007,83:306-314.

[9]Mejáre M,Bülow L.TrendsBiotechnol.,2001,19(2):67-73.

[10]Tsuji N,Hirayanagi N,Okada M,Miyasaka H,Hirata K,Zenk M H,Miyamoto K.Biochem.Biophys.Res.Commun.,2002,293:653-659.

[11]Jian M F,Gong X F,You H，Feng Y L,Yang X H.J.NanchangUniv.:Eng.Technol.(简敏菲，弓晓峰，游海，冯雅玲，杨旭辉.南昌大学学报:工科版),2004,26(1):85-88.

[12]Choo T P,Lee C K,Low K S,Hishamuddin O.Chemosphere,2006,62:961-967.

[13]Gawel J E,Friedland A J.Nature,1996,381:64-65.

[14]Gawel J E.Hemond H F.Environ.Pollut.,2004,131:125-135.

[15]Bona E,Marsano F,Cavaletto M,Berta G.Proteomics,2007,7(7):1121-1130.

[16]Guo H L.Nat.Sci.J.HarbinNorm.Univ.(郭鸿亮.哈尔滨师范大学自然科学学报),2010,3:79-86.

[17]Bhargava P,Srivastava A K,Urmil S,Rai L C.J.PlantPhys.,2005,162:l220-l225.

[18]Jiang Y B,Ji H B.ProgGeogr.(江用彬，季宏兵.地理科学进展),2007,26(1):56-67.

[19]Sun Q,Ye Z H,Wang X R,Huang M H.J.NanjingUniv.:Nat.Sci.(孙琴，叶志鸿，王晓蓉，黄铭洪.南京大学学报:自然科学版),2005,41(3):304-310.

[20]Li B,Liu L,Wang Q Q,Yan H,Huang B L.Spectrosc.SpectralAnal.(李彬，刘丽，王秋泉，严华，黄本立.光谱学与光谱分析),2010,30(4):1096-1100.

[21]Ferrarello C N,del Rosario Fernández de la Campa M,Carrasco J F,Sanz-Medel A.Anal.Chem.,2000,72:5874-5880.

[22]Beattie J H,Wood A M,Duncan G J.Electrophoresis,1999,20:1613-1618.

Analysis of Peptide[γ-(Glu-Cys)n-Gly]by HPLC-Trap-MS Based on Accurate Mass Number

LI Jing-xi1*,ZHAO Jin-quan1,2,YIN Xiao-fei1,SUN Cheng-jun1,CHEN Jun-hui1,ZHENG Li1,WANG Xiao-ru1

(1.Marine Ecology Research Center,First Institute of Oceanography of State Oceanic Administration,Qingdao266061，China;2.College of Public Health of Qingdao University,Qingdao266021，China)

Based on the incremental regularity ofγ-(Glu-Cys)n-Gly series compouds,the qualitative and quantitative analyses of peptides were achieved by using Trap-MS ion screening function.The thiol groups(—SH) of PC2-PC6could react with the monobromobimane(mBBr) to get polypeptide derivatives with fluorescent signal,and the reaction proportion of PCs and mBBr was 1∶1 identified by Trap-MS,which also showed that the intensity of the polypeptide derivatives was stable in 1 week.HPLC-Trap-MS and the chromatographic conditions of HPLC were optimized.The ion extraction results showed that the method was rapid and accurate,and the compound separation effect was obvious,PC2,PC3,PC4,PC5and PC6had wide linear ranges with linear correlation coefficients more than 0.999,and the detection limits were 0.13,0.02,0.17,0.39,0.82 mg/L,respectively.The recoveries were in the range of 89.0%-99.5%,and the method was reproducible with RSDs less than 3.5%.The quantitative analysis under the double detectors of the fluorescence and the mass spectrum could be realized by the fluorescence labeling and Trap-MS screening of peptide compound,which could be used to analyse polypeptide compounds rapidly and accurately.The content of polypeptide in alga was detected after being induced by Zn and Cd,and the results showed that the polypeptide had an induced response to the metal,in which the small molecular peptide changed obviously,the induced response of peptide to the heavy metal was delayed with the increase of the carbon chain.

polypeptide;fluorescence labeling;HPLC;mass spectrometric characterization;ion extraction

2015-10-29；

2015-12-14

国家青年自然科学基金(41106111/41306074)；孙承君-2012泰山学者海外人才项目；国家基金委-山东省联合基金项目(U1406403)

李景喜，博士，助理研究员，研究方向:海洋化学，Tel:0532-88967105，E-mail:jxli@fio.org.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.006

O657.63;O629.7

A

1004-4957(2016)06-0668-06