基于单螺旋微流控芯片的细菌气溶胶的高效富集

蓝　英，徐　娟，卞晓军，赵　勇,2,3，潘迎捷,2,3，张炜佳,2,3*

(1.上海海洋大学　食品学院，上海　201306；2.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室，上海　201306；3.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海　201306)



基于单螺旋微流控芯片的细菌气溶胶的高效富集

蓝英1，徐娟1，卞晓军1，赵勇1,2,3，潘迎捷1,2,3，张炜佳1,2,3*

(1.上海海洋大学食品学院，上海201306；2.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室，上海201306；3.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海201306)

设计了一种单螺旋通道的聚二甲基硅氧烷(Poly(dimethylsiloxane),PDMS)微流控芯片，用于副溶血性弧菌气溶胶的快速有效富集。该芯片的特征在于其通道呈螺旋分布，且通道内部含有均匀分布的鱼骨形结构。结果表明，在不同富集时间段内，采用该芯片方法捕获的细菌总数均远高于传统落板法。对于传统落板法无法有效捕获的低浓度样本(104CFU/mL)的缺陷，该方法的优势在于：芯片内部的螺旋通道可增大对气溶胶中微生物的离心力；鱼骨形结构的设计增加了待测样品与芯片内壁间的接触几率。此外，以无鱼骨形的螺旋芯片作为对照，验证了鱼骨形结构对于高效富集的意义。此芯片设计巧妙、易于制备、高效便携、富集效果较好，在气溶胶污染严重的水产加工等场所具有较大的应用前景。

单螺旋微流控芯片；副溶血性弧菌；富集；鱼骨结构

气溶胶是指悬浮在空气中的液体或固体颗粒物的胶态系统。如果气溶胶中包含微生物则被称为微生物气溶胶[1]。微生物气溶胶对人类的生命健康具有极大影响，全球因微生物气溶胶引起的呼吸道感染率高达20%，世界上约有500多种致病菌，经气溶胶传播的至少有100多种[2]。我国疾病感染亦以呼吸道感染率最高。曾肆虐全球的非典型肺炎病毒(又名SARS病毒)是最典型的微生物气溶胶传播；此外，对于禽流感、甲型流感以及目前在局部地区肆虐的手足口病等流行病、传染病，微生物气溶胶都是其重要的传播途径[3-4]。

副溶血性弧菌是一种广泛存在于海水、海底沉积物以及鱼、虾、贝等海产品中的常见革兰氏阴性嗜盐细菌[5]，是海水养殖中重要的条件致病菌，也是我国沿海地区食物中毒和夏季腹泻的重要病原，高居微生物性食物中毒首位[6-7]。在水产品的加工处理过程中，制造的悬浮颗粒污染尤为明显。通常，在加工过程中产生的肌肉、内脏、表皮、粘液和胶原蛋白等大量碎末可能含有副溶血性弧菌，造成室内污染甚至是室外一定区域范围内的污染，引起人类腹痛、呕吐、腹泻等疾病。因此，评估水产品加工场所的副溶血性弧菌污染对于保障食品安全具有重要意义。

现阶段对微生物气溶胶进行采样的最基本最常用的方法为传统的自然落板法以及借助仪器进行采样的方法。自然落板法由科赫于1881年创立，该方法中，空气中微生物颗粒在重力作用下沉降到琼脂培养基上[8]。机械采样法根据采样原理的不同，可分为沉降模式、震动模式、离心撞击式、过滤模式、电化学采样类以及气流分离器等[9]。目前尚无生物气溶胶户外监测的标准方法。因而开发灵敏、高效、可重复、便携的生物气溶胶采样器具有重要的现实意义。微流控芯片因具有体积小、比表面积大、试剂和样品用量少、反应时间短、分析速度快、灵敏度高、易集成化及自动化等优点，非常适用于微生物气溶胶的采样和富集[10]。

本文设计了一个具有鱼骨形结构和螺旋通道的聚二甲基硅氧烷(Poly(dimethylsiloxane),PDMS)微流控芯片，并将其用于副溶血性弧菌气溶胶的富集。芯片采用螺旋通道设计，使气体在其中流动时受较大的离心力影响而在芯片侧壁上富集，采用的鱼骨形结构也能增加气溶胶中微生物与管道内壁的接触几率，双方协同作用可增加富集效率。文中还讨论了富集时间和流速对富集效率的影响。设计了一个具有相同螺旋通道而没有鱼骨形结构的微流控芯片，以验证鱼骨形结构对富集效率的影响。实验结果表明，该芯片使用方法简单、快速、便携，在微生物气溶胶富集方面具有较大的应用潜力。

1　实验部分

1.1材料与仪器

1.1.1细菌副溶血性弧菌ATCC 33847，美国菌种保藏中心。

1.1.2试剂乙醇(分析纯，上海展云化工有限公司)；氯化钠(分析纯，上海生工生物工程有限公司)；胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB，北京陆桥技术有限责任公司)；硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(TCBS，北京陆桥技术有限责任公司)；SU-8 2050光刻胶(美国MicroChem公司)；Sylgard 184硅橡胶弹性体和Sylgard 184固化剂(美国Dow Corning公司)。

1.1.3仪器设备URE-2000/35型光刻机(中科院光电技术研究所)；2XZ-2型真空泵(上海酷瑞泵阀制造有限公司)；BPZ-6063LC型真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；KW-4A型台式匀胶机；BP-2B型烘胶台；WH-1000等离子表面处理机；LSP01-1A型微量注射泵；ZJ-250型真空搅拌器(保定兰格恒流泵有限公司)；Eppendorf 离心机(美国 Eppendorf 公司)；Bio-Tek 酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；ZR-1050型气溶胶发生器(青岛众瑞智能仪器有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1微流控芯片的设计与加工本实验设计的单螺旋微流控芯片如图1所示，分为单螺旋通道层和鱼骨结构层。单螺旋通道高为130 μm，宽为600 μm，螺旋底面半径4 000 μm，顶面半径14 000 μm，螺旋圈数为3圈，进出口直径均为2 000 μm。鱼骨形结构由两个平行四边形拼接而成，角度为100°，高为130 μm，长为600 μm，宽为150 μm，鱼骨形结构沿螺旋通道均匀分布，分布间距为1 000 μm。

该微流控芯片采用多次软光刻技术以及模塑法制作。具体工艺流程如图2所示。芯片制作的关键工艺是制作双层的SU-8负性光刻胶模具以及热键合法制作双层PDMS微流控芯片。首先利用多次曝光，一次显影的工艺制作SU-8光刻胶双层的芯片模具[11]。将SU-82.50光刻胶甩涂至清洗干净的硅片基底上，厚度约为130 μm，在烘胶台上前烘(Soft bake)，即65 ℃加热5 min，95 ℃加热30 min后，缓慢降至室温。将设计好的单螺旋通道掩模放置于甩涂光刻胶的基片上，应用光刻机曝光后，将硅片置于烘胶台后烘(Post bake)，即65 ℃加热5 min，95 ℃加热12 min后，缓慢降至室温。第一层单螺旋通道图形即可转移至SU-8光刻胶上。再重复甩胶和前烘，将鱼骨形结构掩模与第一层的单螺旋通道对准，第二次曝光和后烘，最后显影并用氮气吹干，即形成双层图形结构的SU-8模具。

聚二甲基硅氧烷单体及固化剂按质量配比10∶1混匀，倒在SU-8模具上，在真空干燥箱中抽真空除尽气泡，80 ℃加热20 min。冷却后将PDMS从模具上剥离，在管道的入口和出口处打孔，将该层PDMS与空白PDMS经氧等离子体处理后贴合，放置于烘箱内80 ℃加热2 h，完成PDMS的热化学键合反应，形成封闭通道，完成微流控芯片的制作[12-14]。PDMS芯片管道的内表面分别用酒精、HCl(1.0%)，H2O2(1.0%)以及超纯水冲洗后，用洁净的空气吹干备用[15]。

1.2.2气溶胶样品的制备将副溶血性弧菌接种于含10 mL TSB(含30 g/L NaCl)的试管中，于37 ℃下以180 r/min摇床培养10 h，连续活化2次。细菌培养液离心后重悬于0.85%生理盐水中，将终浓度调至108CFU/mL。将100 mL菌液置于气溶胶发生仪中产生一定浓度的气溶胶，气溶胶发生器产生气溶胶的时间设定为10 min。将产生的副溶血性弧菌气溶胶通入盛有20 mL 0.85%生理盐水的烧杯中，用封口膜密封烧杯。将收集气溶胶后的液体梯度稀释后涂布于TCBS平板，于37 ℃培养箱中倒置培养24 h。获得菌落数后计算出副溶血性弧菌气溶胶的浓度。实验重复3次。

1.2.3芯片富集系统实验装置如图3所示。利用气溶胶发生器将一定浓度的菌悬液喷制成细菌气溶胶进入容积108 L(60 cm×45 cm×40 cm)的密闭亚克力缸中。空气中副溶血性弧菌颗粒在重力作用下沉降到TCBS琼脂培养基上，将落板法收集的细菌样本于37 ℃培养箱24 h。在微型真空泵的作用下，细菌气溶胶进入微流控芯片，并被物理性富集。未被富集的细菌则顺着出口的管道进入1.5 mL离心管中被收集[16]。富集完成后，用100 μL TSB液体培养基将富集在芯片管道的细菌反向洗脱。将洗脱后的菌液梯度稀释涂布于TCBS平板，于37 ℃培养箱中倒置培养24 h。

1.2.4流速对富集效率的影响富集时间设定为3 min，观察不同流速下(1.6，4.0，6.4 mL/min)微流控芯片的富集效率，选定最优流速。每个实验重复3次。

1.2.5芯片富集效率分析了最优流速下不同的富集时间(0，3，6，9，12，15，20，30，40 min)微流控芯片的富集效率，同时以落板法作为对照。每个实验重复3次。

1.2.6微流控芯片与落板法的比较为了检测微流控芯片对副溶血性弧菌气溶胶的富集效果，实验配制了4种不同浓度的副溶血性弧菌菌液(107，106，105，104CFU/mL)，均通过初始浓度为108CFU/mL的菌液梯度稀释得到。富集时间设定为20 min，流速为最优流速。同时以传统的落板法作为对照。每个实验重复3次。

1.2.7鱼骨结构对富集效率的影响实验对比了有鱼骨结构微流控芯片与无鱼骨结构微流控芯片的富集效率(除有无鱼骨结构外无其他区别)。实验富集时间设定为10 min，流速为最优流速。每个实验重复3次。

1.2.8副溶血性弧菌的统计分析将落板法收集的细菌样本和微流控芯片富集的细菌样本于37 ℃培养24 h，计算平板上生长的细菌菌落数。

1.2.9数据处理与分析记录通过培养后细菌的菌落数。芯片的富集效率=富集在芯片中的菌落数/(富集在芯片中的菌落数+溢出芯片的菌落数)。

2　结果与讨论

2.1微流控芯片的设计与加工

通过微加工技术制作微流控芯片的模具由SU-8负性光刻胶制作。SU-8光刻胶具有良好的力学性能和抗化学腐蚀性，不仅可以制作高深宽比的厚膜图形，同时还能通过多次光刻形成具有多层结构的复杂图形[17]。本实验的芯片模具采用两次曝光，一次显影的方法制作，方法简便易行、经济耐用。

通过热键合方式将具有图案的PDMS与空白的PDMS贴合，从而形成封闭通道制作微流控芯片。微流控芯片载体的材料很多，最常见的是硅片、玻璃，以及聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、PDMS等聚合物。硅片不透明且刚性较大，成本较高；玻璃要加工制作复杂的多层结构比较困难，工艺复杂；PMMA等聚合物则由于其本身的物理化学性质，加工精度难以达到要求。而PDMS是目前微流控技术中被广泛应用的材料，具有很好的透光、透气性和生物相容性，成本低，加工工艺简单，重复性好[18]。此外通过热化学反应，两层未完全固化的PDMS之间的界面可发生交联，完成两层PDMS的键合。通过这种方法键合的微流控芯片，可以承受6×105Pa以上的压力[19]。

2.2气溶胶样品制备

细菌计数采用平板计数法。20 mL 0.85%生理盐水中含有的细菌浓度约为8.80×105CFU/mL，细菌总数约为1.76×107CFU。因此，分散到108 L密闭亚克力缸中的副溶血性弧菌气溶胶浓度约为163 CFU/mL。

2.3芯片富集系统及富集机制

整个装置对副溶血性弧菌的富集机制如下：一定浓度的菌悬液在气溶胶发生器的作用下被喷制成副溶血性弧菌气溶胶进入密闭亚克力缸中。在微型真空泵的作用下，副溶血性弧菌气溶胶被泵入微流控富集芯片通道中。进入芯片通道的细菌在离心力及鱼骨结构的作用下，粘附到通道内壁上。如果产生未被富集的细菌，则会顺着出口的管道进入离心管中的TSB培养基中。

2.4流速对富集效率的影响

如表1所示，当流速从1.6 mL/min增至4.0 mL/min时，富集的细菌总数明显增多。但当流速继续增至6.4 mL/min时，有未被富集的细菌从出口逸出，富集效率从100%降至96.67%。流速增加，富集的细菌总数升高，但过快的流速增加了目标细菌从富集管道逸出的风险。因此，最终选定4.0 mL/min为最优流速。

表1　不同流速对副溶血性弧菌富集效率的影响

2.5时间对富集效率的影响

富集效率随时间的变化情况如表2所示。以富集时间0 min作为对照，没有副溶血性弧菌在0 min检出。当实验时间为3 min时，检出21个菌落，而落板法只检出7个菌落。在6，9，12，15，20，30，40 min富集的细菌数量分别为180，2 257，4 767，9 133，11 600，14 933和17 300个。落板法富集的细菌数量分别为27，88，117，237，296，319和336个。当富集时间达到40 min时，约有9个细菌从离心管收集的液体中检出。在实验的前30 min内，进入管道的细菌均被富集，即芯片的富集效率达100%。由此可见，在30 min内，所设计的微流控芯片能够有效富集副溶血性弧菌。

表2　微流控芯片富集时间对副溶血性弧菌富集效率的影响

2.6微流控芯片与落板法的比较

对比了由微流控芯片富集的副溶血性弧菌数与落板法培养得到的副溶血性弧菌数。结果表明，在20 min的富集时间内，副溶血性弧菌在4种浓度(104，105，106，107CFU/mL)下均可通过微流控芯片富集得到。当副溶血性弧菌的浓度为107CFU/mL时，微流控芯片收集的副溶血性弧菌数目约为570个，而落板法仅有86个。利用微流控芯片富集的副溶血性弧菌数目是落板法的6.63倍。当副溶血性弧菌的浓度为106CFU/mL时，微流控芯片富集的细菌数目为294个，落板法则为19个。当副溶血性弧菌的浓度为105CFU/mL时，微流控芯片富集的细菌数目为65个，落板法仅为5个。利用微流控芯片富集的副溶血性弧菌数比落板法高出12倍。当副溶血性弧菌的浓度降至104CFU/mL时，微流控芯片可富集到3个细菌，而落板法则无细菌被富集。由实验结果可知，微流控富集芯片能够在很短的时间内高效富集低浓度的副溶血性弧菌，且富集到的数量远高于传统的落板法。

2.7有鱼骨结构的富集芯片与无鱼骨结构的富集芯片效率对比

对比了有、无鱼骨结构存在下，微流控芯片的富集效率，无鱼骨结构的微流控芯片结构如图4所示。结果显示，实验时间为6 min时，有鱼骨结构存在的芯片的富集效率比无鱼骨结构的微流控芯片的富集效率高。有鱼骨结构存在时，微流控富集芯片对副溶血性弧菌的富集效率为100%(约富集273个副溶血性弧菌，无细菌从管道中逸出)。而无鱼骨结构的富集芯片对副溶血性弧菌的富集效率为93.48%(约258个细菌被富集，18个细菌从出口逸出)。由此可见，鱼骨结构在对副溶血性弧菌的富集过程中发挥了重要作用。这种结构可以打破流体在通道内的平流状态，变为无序混乱的状态，从而增加气溶胶中微生物与管道内壁的接触几率，提高微流控芯片的富集效率[17]。此外，螺旋通道可利用离心力增大气溶胶中的微生物与管道壁的接触几率，提高富集效率。

表3　鱼骨结构和无鱼骨结构的微流控富集芯片富集效率对比

3　结　论

本文设计了一个具有鱼骨形结构的螺旋式PDMS微流控芯片，并将其用于副溶血性弧菌气溶胶的富集，该芯片对副溶血性弧菌的富集效率达100%，远高于传统的落板法。高富集效率得益于芯片的鱼骨形结构和螺旋通道的协同作用。芯片采用的螺旋通道设计，增大了气体在其中流动时所受到的离心力，从而使气溶胶中的微生物在芯片侧壁上得到富集；而鱼骨形的结构设计增加了气溶胶中微生物与管道内壁的接触几率。对于传统落板法无法捕获到的低浓度细菌气溶胶，该芯片的富集优势更为突出。通过设计没有鱼骨结构的对照芯片，进一步证实了鱼骨形结构对于富集效率的提高发挥了较为关键的作用。整个微流控富集芯片因结构设计巧妙，加工方法简单，应用操作便捷，在微生物气溶胶快速富集方面具有很好的应用前景。为了进一步验证该芯片对微生物气溶胶的富集效果，本研究将继续优化芯片及整体器件，并建立多重荧光定量PCR方法用于检验多种微生物气溶胶的富集效果。

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Highly Efficient Enrichment of Bacteria Aerosol Based on a Single Spiral Microfluidic Chip

LAN Ying1,XU Juan1,BIAN Xiao-jun1,ZHAO Yong1,2,3,PAN Ying-jie1,2,3,ZHANG Wei-jia1,2,3*

(1.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai201306,China；2.Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation,Shanghai201306,China；3.Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Aquatic Products on Storage and Preservation(Shanghai),Ministry of Agriculture,Shanghai201306,China)

Highly efficient enrichment is the key for rapid analysis and detection of microbiological aerosol.Herein,a poly(dimethylsiloxane)(PDMS) microfluidic chip which has a single spiral channel was developed,and the chip was used forVibrioparahaemolyticusenrichment.The characteristic of this chip is that it has a single spiral channel which contains a herringbone structure with uniform distribution.During different enrichment times,the number of captured bacteria by microfluidic chip is far bigger than that by the traditional sediment method.Moreover,the chip shows more enrichment advantages when capturing microbiological aerosol in low concentration.This excellent enrichment ability,on one hand,benefits from the unique spiral channel design which can put greater centrifugal force to the microbiological aerosol.On the other hand,the herringbone structures design endows the chip larger surface specific area increasing the contact probability between microbiological aerosol and chip.In addition,a similar spiral microfluidic chip without herringbone structures was also designed.The results validated the contribution of herringbone structures to the enrichment efficiency. With the advantages of delicate design and fabrication,portability and high enrichment capacity,this microfluidic chip shows a great application potential in field like aquatic products processing industry.

single spiral microfluidic chip；Vibrioparahaemolyticus；enrichment；herringbone structure

2015-11-22；

2015-12-11

国家自然科学基金项目(31501555,21405167)；中组部青年千人项目；上海市青年东方学者项目；上海市科委项目(14DZ1205100,14320502100)；浦江人才计划(14PJ1404300)；上海市科技兴农重点攻关项目(沪农科攻字2015第4-8号)；上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心(11DZ2280300)

张炜佳，博士，教授，研究方向：微流控生物化学分析技术，Tel:021-61908113,E-mail:wj-zhang@shou.edu.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.001

O657.1;R378

A

1004-4957(2016)06-0635-06

研究报告