高危型HPV E2在宫颈癌细胞中的表达及其意义

丁文艳　钟天鹰　高玲娟



高危型HPV E2在宫颈癌细胞中的表达及其意义

丁文艳钟天鹰高玲娟

宫颈癌是世界范围内威胁女性健康的常见生殖道恶性肿瘤,人类乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV)感染是导致宫颈癌及其相关病变的首要因素[1],组织学确诊为侵袭性宫颈癌(ICC)的病例中,99.7% HPV DNA为阳性,其中HPV 16占51%,HPV 18占12.6%～25.7%[2]。研究揭示,高危型HPV E2作为一种反式调控因子,控制E6和E7基因的持续表达进而影响宫颈癌细胞的增殖[3],为进一步明确高危型HPV E2与宫颈癌的关系,我们在此探讨高危型HPV E2在宫颈癌中的表达及其生物学意义。

1　材料与方法

1.1材料收集2009年3月至2013年2月间,于南京市妇幼保健院行宫颈癌手术患者的肿瘤组织30例,同时收集相应的癌旁正常宫颈组织(距肿瘤组织>5 cm)做为对照,置于液氮冻存备用。按年龄分为≥60岁的老年组与<60岁的非老年组。老年组12例,平均年龄(65.24±4.24)岁,非老年组18例,平均年龄(45.24 ± 3.87)岁。

1.2细胞培养宫颈癌细胞株SiHa由杭州赫贝生物公司提供。细胞接种于完全营养液中,每50 ml培养瓶中加入6 ml完全营养液(15%胎牛血清,100 U/ml青霉素,100 U/ml链霉素,以及非必需氨基酸10 ml/L,pH 7.2),置37 ℃,5%CO2培养箱内培养。

1.3实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time PCR，RT-PCR)PCR反应体系构成为20 μl，含0.1 μmol/L荧光标记探针、1×TaqMan Universal PCR Master Mix (ABI)、引物各0.2 μmol/L及DNA模板100～200 ng。ABI Prime 7300定量PCR检测仪进行检测，反应参数为：50 ℃/2 min，95 ℃/3 min，95 ℃/15 s，60 ℃/2 min，40个循环测试，单点荧光在60 ℃进行检测。选择FAM荧光检测模式，每孔设3个复孔。采用以下公式进行计算实验数据：2-△△CT=2-(CT.HPV E2- CT.actin)Time x + (CT. HPV E2- CT.actin)Time 0。

1.4质粒转染及表达鉴定 转染前24 h，宫颈癌细胞传代至9孔培养板，每孔2.0 × 105个细胞。将宫颈癌细胞分为实验组，转染高危型HPV E2载体，对照组转染空载体，空白组不经任何处理。用100 μl Opti-MEM稀释1.6 μg质粒DNA，轻轻吹吸4次，室温放置10 min。用100 μl Opti-MEM稀释4.0 μl Lipofectamine，轻轻吹吸4次，室温放置20 min。将质粒DNA和转染试剂混合，室温下放置30 min。将培养的宫颈癌细胞(80%)弃培养液，不完全营养液洗涤细胞5次；将混合液加入细胞上；于37 ℃ 5% CO2孵箱转染6 h，换液，加入完全培养液，继续培养24 h；转染效率以荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达进行判断，通过GFP的表达确定收获细胞的最佳时段。

1.5宫颈癌组织的胞浆蛋白提取Western blot 提取宫颈癌组织的胞浆蛋白,取100 μg总蛋白上样,采用等体积的1×loading buffer进行电泳,初始电压为45 V,电压达到65 V后,改用稳压电泳。当目的蛋白泳动至距胶下缘1 cm以上时,结束电泳实验。湿法电转移至PVDF膜,将膜置于封闭液中,室温封闭2 h,放进含小鼠抗人高危型HPV E2单克隆抗体释液中,摇床上37 ℃孵育2 h,TBST洗涤15 min×3次。将膜放进含抗小鼠IgG二抗稀释液中,摇床上室温孵育1 h,TBST涤15 min×3次。暗室中剪适合大小的胶片压在膜上15 s,将胶片放入显影液中反应1 min,取出滴干液体放入水中冲洗,放入定影液中定影5 s,自来水冲洗。

1.6MTT法(methyl thiazolyl tetrazolium，甲基噻唑基四唑)检测细胞增殖活性收集对数期宫颈癌细胞，调整细胞浓度至6 ×105/ml，将细胞悬液接种于96孔板，5% CO2、37 ℃培养箱内培养48 h，倒置显微镜下观察。每孔加入20μl MTT，37 ℃培养4 h。加入1 M的DMSO 150 μl，低速震荡15 min，充分溶解结晶物。OD 490 nm波长，酶联免疫检测仪读取吸光度(A)值。以公式：细胞存活率=实验组A值/对照组A值×100%。

1.7流式细胞仪检测宫颈癌细胞凋亡率 胰酶消化对数期生长的宫颈癌细胞，收集各组细胞，调整其浓度至5 ×106/ml。500～1000 r/min离心10 min，弃去培养液。用预冷，4 ℃无菌的PBS充分洗涤细胞3次，用200 μl结合缓冲液重新悬浮细胞。加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl 的PI溶液，室温下，避光孵育30 min。将试管置于冰上，与Annexin V-FITC/PI孵育10 min后，流式细胞仪检测宫颈癌细胞凋亡情况。

2　结果

2.1高危型HPV E2在宫颈癌和癌旁正常组织中的表达水平RT-PCR结果显示,癌旁正常组织中高危型HPV E2 mRNA的表达(0.87± 0.31)显著增高,但其相对应的宫颈癌组织中高危型HPV E2 mRNA的表达明显减少(0.35 ± 0.16),差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot检测高危型HPV E2蛋白的表达水平表明,宫颈癌组织中高危型HPV E2蛋白明显减少(0.26 ± 0.12),与相应的宫颈癌旁正常组织(0.74 ± 0.36)比较差异有统计学意义(P<0.01)。其中,老年组高危型HPV E2(0.28 ± 0.14)在宫颈癌组织中的表达显著低于非老年组(0.76 ± 0.29)(P<0.01)。

2.2高危型HPV E2对宫颈癌细胞株SiHa增殖及凋亡的影响采用MTT检测转染高危型HPV E2质粒,对宫颈癌细胞株SiHa增殖的影响,高危型HPV E2组,其细胞存活率与PBS组比较,差异具有统计学意义(P<0.01),但空载体组与PBS组比较差异无统计学意义(P>0.05)。宫颈癌细胞的凋亡情况,高危型HPV E2组,其凋亡细胞数与PBS组比较显著增加,差异有统计学意义(P<0.01),但空载体组与PBS比较,其差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

项目高危型HPVE2空载体PBS存活率24±4**78±882±9凋亡率83±9**28±331±4

注:与PBS组比较,**P<0.01

3　讨论

世界上宫颈癌新发病例47万例/年,其中中国占新发病例总数的28.8%[4]。宫颈癌的病因学研究已经证实,高危型HPV感染是导致宫颈癌及其相关病变的重要因素[5],因此深入探索高危型HPV感染对宫颈癌发生发展的影响成为预防医学领域疾病早期防治的一个热点研究内容。

国际癌症研究机构(IARC)调查显示,宫颈癌在中老年妇女发生率较高,与年轻妇女相比,其也有较高的死亡率。高危型HPV16、18型与宫颈癌的发生密切相关,其感染宫颈上皮的基底细胞和基底周围细胞后,其基因片段或者整个DNA可以整合到宿主细胞基因组中。早期编码区(early region,E区)起始编码E1、E2、E5、E6、E7蛋白,其中高危型HPV E2、E6、E7基因与HPV致瘤密切相关[6]。本研究结果揭示:不仅宫颈癌组织中高危型HPV E2基因明显少于相应的宫颈癌旁正常组织,而且老年组高危型HPV E2在宫颈癌组织中的表达显著低于非老年组,表明老年人宫颈癌的高发生率与致死率与高危型HPV E2表达有密切的相关性。

研究揭示,高危型HPV E2既调节病毒的转录又调节病毒的复制,且通过多种途径影响细胞的生物学特性。作为一种反式调控因子,其可通过控制E6和E7基因的持续表达影响宫颈癌细胞的增殖[7],可通过调控p53和pRB蛋白诱导宫颈癌细胞凋亡[8]、也可通过引发线粒体功能障碍导致宫颈癌细胞凋亡[9]。本研究结果揭示,高危型HPV E2可显著抑制宫颈癌细胞的增殖活性,导致宫颈癌细胞的凋亡效应。以上结果提示,高危型HPV E2在宫颈癌细胞中的低表达,使肿瘤细胞逃避凋亡得以发生无限增殖。如果将高危型HPV E2作为宫颈癌治疗的潜在靶点,进而寻找有效高危型HPV E2表达的新疗法,从而提高传统宫颈癌疗法的效果具有重要的临床意义。

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南京市医学科技发展基金(YKK14123)

210004江苏省南京市,南京医科大学附属南京妇幼保健院检验科

高玲娟，Email：gaolingjuan@njmu.edu.cn

R 737.33

Bdoi:10.3969/j.issn.1003-9198.2016.03.021

2015-05-21)