血小板C型凝集素样受体-2与血栓性疾病研究进展

王浩　骆雷鸣



血小板C型凝集素样受体-2与血栓性疾病研究进展

王浩骆雷鸣

王浩　教授

血小板黏附、激活及聚集在暴露的内皮下细胞外基质(extracellular matrix,ECM)是止血过程必不可少的步骤。此步骤涉及多个环节及多个血小板受体-配体反应。其中,血小板黏附反应主要涉及的受体为血小板糖蛋白(glycoprotein,GP)Ib-V-IX复合物与整合素,激活与聚集反应主要涉及GPVI及C型凝集素样受体-2(C-type lectin-like receptors-2, CLEC-2)[1-3]。

CLEC-2是近年发现的在血小板表面表达的信号受体,在最初通过生物信息学技术鉴定CLEC-2之后,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及印迹杂交(northern blot)分析技术发现CLEC-2 mRNA在肝脏细胞、多种造血细胞(包括单核细胞、树突细胞、NK细胞及粒细胞)中有表达[4]。后来发现CLEC-2蛋白在人类血小板、巨核细胞系、肝窦内皮细胞、肝脏枯否细胞均有表达[5-6]。相比而言,CLEC-2在血小板和巨核细胞内相对特异表达,而在其他类型细胞内表达水平较低[7]。既往研究发现,CLEC-2激活后可以诱导血小板聚集。本文就CLEC-2与血栓性疾病的研究进展综述如下。

1　结构与信号转导

CLEC-2是在研究蛇毒蛋白(rhodocytin)引起凝血及血栓形成的血小板受体时鉴定出来的。Rhodocytin依赖Src家族激酶激活血小板,但并不依赖胶原受体GPVI/FcRγ链复合物,而后者是已知经典的依赖Src激酶激活血小板的受体途径[8],所以推测有另一种受体途径介导了rhodocytin所诱导的血小板聚集作用。最终应用rhodocytin亲和色谱法及质谱分析法确定CLEC-2是rhodocytin在血小板表面的受体[3]。

CLEC-2是一种32～40 kDa的Ⅱ型跨膜受体,携带一个C型凝集素样结构域。C型凝集素通过碳水化合物识别域以一种钙离子依赖模式与碳水化合物结合,而CLEC-2属于非典型的C型凝集素样蛋白,同样含有与碳水化合物识别域同源的C型凝集素样结构域,但是缺乏与糖和钙离子结合的共有序列[4]。CLEC-2是凝集素受体家族第一个通过酪氨酸激酶依赖途径刺激血小板聚集的成员。

CLEC-2 的信号转导主要利用FcRγ的胞浆侧尾部的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)[9],每个ITAM包含2个保守的YXXL序列,由6～12个氨基酸分开,rhodocytin与CLEC-2发生配体受体反应后使YXXL磷酸化,与Syk的串联SH2结构域结合,引发激酶活化。CLEC-2拥有单个YXXL,其可以通过2个磷酸化的受体之间通过串联的SH2结构域进行桥接形成二聚体,1个Syk的串联SH2结构域与2个分子的磷酸化的YXXL以2:1形式结合[10-11],而后激活Syk。CLEC-2激活Syk后启动适配体及效应蛋白信号级联反应,下游信号分子与GPVI一致,包括LAT、SLP-76、Vav1/3的酪氨酸磷酸化,效应蛋白包括Btk及磷脂酶Cγ2 (phospholipase Cγ2, PLCγ2)[12],并最终激活PLCγ2并募集PLCγ2至细胞膜[13-14]。人类血小板CLEC-2的激活严格依赖ADP、血栓素A2(thromboxane A2, TxA2)及肌动蛋白聚合的反馈反应[15]。另外,CLEC-2通过调节PI3K及PKC的下游信号分子Akt及MAPK,引起糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase,GSK)3α/β的磷酸化及抑制,增强血小板聚集及分泌[16]。CLEC-2信号转导途径见图1[17]。

目前唯一已知的CLEC-2内源性配体是podoplanin,在脉管系统外的多种细胞表达[18]。Rhodocytin是CLEC-2外源性配体,是一种强力血小板激活蛋白,由马来亚蝮蛇分离获取[3]。另外,盐藻多糖作为血友病的治疗药物,可以激活血小板,缩短血友病患者出凝血时间,其激活血小板功能在CLEC-2敲除的小鼠血小板被抑制,提示盐藻多糖是一种新型CLEC-2激动剂[19]。

图1　CLEC-2信号转导途径

一种新型非细胞毒的5-硝基苯甲酸盐化合物2CP是目前第一个确定的血小板CLEC-2拮抗剂[20],其利用与podoplanin相同的结合单元直接竞争性结合CLEC-2,抑制podoplanin诱导的血小板激活。

CLEC-2的下游信号转导还可能与双重特异性磷酸酶3(dual-specificity phosphatase 3,DUSP3)有关[21]。DUSP3在人和小鼠血小板高度表达,在DUSP3缺陷的小鼠的血小板,由胶原受体糖蛋白VI和CLEC-2介导的血小板聚集和颗粒释放反应选择性受损。与野生型小鼠相比,DUSP3缺陷的小鼠更加不易发生胶原和肾上腺素诱导的血栓形成。在分子水平,DUSP3缺陷抑制了Syk酪氨酸磷酸化,随后抑制了PLCγ2磷酸化和钙离子流动,从而抑制了血小板激活。

2　与血栓性疾病关系研究

由于CLEC-2潜在的血小板活化作用,推测其可能成为抗血栓药物的靶点[22],但是CLEC-2敲除小鼠的致命性,使得关于该受体在凝血及血栓形成中的功能研究变得非常困难。第一项直接涉及此问题的研究,是通过抗体来免疫耗竭小鼠血液循环中的CLEC-2完成的,静脉内注射单克隆抗CLEC-2 IgG抗体INU1 可导致血小板表面受体下调超过6 d[23]。 与抗体(JAQ1)介导的GPVI下调类似,血小板计数在4 d后恢复,新生血小板缺乏CLEC-2[24],CLEC-2耗竭的血小板对rhodocytin无反应,这种缺陷高度特异,因为血小板对于所有其他检测用激活剂的激活和聚集反应均无变化[23]。很快,有团队在CLEC-2缺陷的嵌合子小鼠的造血系统内,报道了同样确切的反应缺陷[25]。进一步揭示了CLEC-2对于稳定血小板聚集的重要作用。

在全血液灌注分析中,CLEC-2耗竭的血小板能够正常黏附在胶原覆盖的表面,但随即稳定的聚集形式在中到高的剪切率时遭到严重破坏。在氯化铁所致的肠系膜动脉损伤在体模型中,亦可见到血栓稳定性缺陷,证据是正常血小板可黏附在损伤的血管壁,但是CLEC-2耗竭的血小板却阻碍了血栓形成过程[22]。与此一致,Suzuki-Inoue 等描述了CLEC-2缺陷的血小板如预期一样对Rhodocytin无反应,但对经典的血小板激活剂如胶原、凝血酶及ADP等诱导血小板聚集有正常反应,包括对胶原、层粘连蛋白及纤维蛋白原等不同基质的黏附反应亦正常,然而CLEC-2嵌合体血小板在血栓形成方面发生了障碍,聚集稳定性出现了异常[25]。基于这些结果,可以推测CLEC-2通过“接手”GPVI的血小板募集功能推动血栓生长,与胶原接触无关。利用抗体同时阻断GPVI及CLEC-2可使凝血功能发生障碍,动脉内血栓形成严重受阻[26]。然而,与这些研究相反,其他学者在体外研究中发现CLEC-2耗竭的血小板聚集功能正常[27]。出现这些矛盾结果的原因暂不明。 CLEC-2在止血过程中似乎扮演了一个小角色,因为在部分血小板存在CLEC-2缺陷的的小鼠,出血时间没有延长或者仅仅中度延长[23]。

既往推测血小板(hem)ITAM、GPVI 及CLEC-2几种受体之间可以互相补偿以防止失血[3],因为有些缺乏GPVI的患者和小鼠只是表现出很轻微的出血倾向[28]。这个问题非常重要,因为涉及到在对有(hem)ITAM信号转导途径有部分缺陷的患者进行针对其他各自的(hem)ITAM受体治疗时,可能引起不可控制的出血。目前涉及血小板之间交互作用的CLEC-2的生理配体尚不明了。推测其可以在活化的血小板上表达或固定[23]。有团队推测CLEC-2的亲同种抗原交互作用可能在此发挥作用[25],但这种观点亦被其他人所质疑。

因为血小板的激活在血栓形成中至关重要,因此检测在体血小板激活对于鉴定病人是否处于血栓风险及监测抗血小板治疗效果有重要意义[29]。利用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测个体血浆中可溶性CLEC-2(soluble CLEC-2,sCLEC-2)浓度,结果发现,10名健康个体平均浓度为(97 ± 55) pg/ml,同时25例糖尿病患者为(149 ± 260) pg/ml,糖尿病患者有升高趋势,可能反映了在体血小板激活情况,提示sCLEC-2作为在体血小板激活情况的生物标记物有重要临床意义。

3　展望

因为CLEC-2缺陷小鼠在影响血栓形成的同时没有明显增加出血倾向,推测CLEC-2可能是抗血小板药物的一个良好的靶点,安全性更高。因此,进一步深入研究CLEC-2将对动脉血栓的治疗和预防提供新的思路。

[1]Savage B, Almus-Jacobs F, Ruggeri ZM. Specific synergy of multiple substrate-receptor interactions in platelet thrombus formation under flow[J].Cell,1998, 94(5): 657-666.

[2]Inoue O, Suzuki-Inoue K, McCarty OJ, et al. Laminin stimulates spreading of platelets through integrin alpha6beta1-dependent activation of GPVI[J].Blood, 2006, 107(4): 1405-1412.

[3]Suzuki-Inoue K, Fuller GL, Garcia A. A novel Syk-dependent mechanism of platelet activation by the C-type lectin receptor CLEC-2[J].Blood,2006,107(4):542-549.

[4]Colonna M, Samaridis J, Angman L. Molecular characterization of two novel C-type lectin-like receptors, one of which is selectively expressed in human dendritic cells[J].Eur J Immunol， 2000,30(5):697-704.

[5]Chaipan C, Soilleux EJ, Simpson P, et al. DC-SIGN and CLEC-2 mediate human immunodeficiency virus type 1 capture by platelets[J].J Virol, 2006,80(18): 8951-8960.

[6]Tang T, Li L, Tang J, et al.A mouse knockout library for secreted and transmembrane proteins[J].Nat Biotechnol,2010, 28(6):749-755.

[7]Kerrigan AM, Dennehy KM, Mourao-Sa D, et al. CLEC-2 is a phagocytic activation receptor expressed on murine peripheral blood neutrophils[J].J Immunol,2009, 182(7): 4150-4157.

[8]Suzuki-Inoue K, Ozaki Y, Kainoh M, et al. Rhodocytin induces platelet aggregation by interacting with glycoprotein Ⅰa/Ⅱa (GPⅠa/Ⅱa, Integrin alpha 2beta 1). Involvement of GPⅠa/Ⅱa-associated src and protein tyrosine phosphorylation[J].J Biol Chem,2001, 276(11):1643-1652.

[9]Watson SP, Herbert JM, Pollitt AY. GPVI and CLEC-2 in hemostasis and vascular integrity[J].J Thromb Haemost, 2010, 8(2):1456-1467.

[10]Watson AA, Christou CM, James JR, et al. The platelet receptor CLEC-2 is active as a dimer[J].Biochemistry,2009, 48(66): 10988-10996.

[11]Hughes CE, Pollitt AY, Mori J, et al. CLEC-2 activates Syk through dimerization[J].Blood, 2010, 115(12): 2947-2955.

[12]Fuller GL, Williams JA, Tomlinson MG, et al. The C-type lectin receptors CLEC-2 and Dectin-1, but not DC-SIGN, signal via a novel YXXL-dependent signaling cascade[J].J Biol Chem, 2007, 282(23):12397-12409.

[13]Severin S, Pollitt AY, Navarro-Nunez L,et al. Syk-dependent phosphorylation of CLEC-2: a novel mechanism of hem-immunoreceptor tyrosine-based activation motif signaling[J].J Biol Chem,2011,286(6):4107-4116.

[14]Hughes CE, Auger JM, McGlade J, et al. Differential roles for the adapters Gads and LAT in platelet activation by GPVI and CLEC-2[J].J Thromb Haemost,2008, 6(12): 2152-2159.

[15]Pollitt AY, Grygielska B, Leblond B, et al. Phosphorylation of CLEC-2 is dependent on lipid rafts, actin polymerization, secondary mediators, and Rac[J].Blood, 2010, 115(20): 2938-2946.

[16]Moroi AJ,Watson SP. Akt and mitogen-activated protein kinase enhance C-type lectin-like receptor 2-mediated platelet activation by inhibition of glycogen synthase kinase 3α/β[J].Thromb Haemost, 2015,13(6): 1139-1150.

[17]Suzuki-Inoue K. Essential in vivo roles of the platelet activation receptor CLEC-2 in tumour metastasis, lymphangiogenesis and thrombus formation[J].J Biochem, 2011,150(2):127-132.

[18]Astarita JL, Acton SE, Turley SJ. Podoplanin: emerging functions in development, the immune system, and cancer[J].Front Immunol, 2012,3: 283.

[19]Manne BK, Getz TM, Hughes CE, et al. Fucoidan is a novel platelet agonist for the c-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) [J].J Biol Chem， 2013,228(11):7717-7726.

[20]Chang YW, Hsieh PW, Chang YT, et al. Identification of a novel platelet antagonist that binds to CLEC-2 and suppresses podoplanin-induced platelet aggregation and cancer metastasis[J].Oncotarget, 2015,6(40):42733-42748.

[21]Musumeci L, Kuijpers MJ, Gilio K, et al. Dual-specificity phosphatase 3 deficiency or inhibition limits platelet activation and arterial thrombosis[J].Circulation，2015,131(6):656-668.

[22]O’Callaghan CA. Thrombomodulation via CLEC-2 targeting[J].Curr Opin Pharmacol,2009,9: 90-95.

[23]May F, Hagedorn I, Pleines I, et al. CLEC-2 is an essential platelet-activating receptor in hemostasis and thrombosis[J].Blood, 2009, 114(22): 3464-3472.

[24]Nieswandt B, Schulte V, Bergmeier W, et al. Longterm antithrombotic protection by in vivo depletion of platelet glycoprotein VI in mice[J].J Exp Med,2001,193(4): 459-469.

[25]Suzuki-Inoue K, Inoue O, Ding G, et al. Essential in vivo roles of the C-type lectin receptor CLEC-2: embryonic/neonatal lethality of CLEC-2-deficient mice by blood/lymphatic misconnections and impaired thrombus formation of CLEC-2-deficient platelets[J].J Biol Chem 2010,285(32):24494-24507.

[26]Bender M, May F, Lorenz V, et al. Combined in vivo depletion of glycoprotein vi and c-type lectin-like receptor 2 severely compromises hemostasis and abrogates arterial thrombosis in mice[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2013,33(7):926-934.

[27]Hughes CE, Navarro-Nunez L, Finney BA, et al. CLEC-2 is not required for platelet aggregation at arteriolar shear[J].J Thromb Haemost, 2010,8(10): 2328-2332.

[28]Boylan B, Chen H, Rathore V, et al. Anti-GPVI-associated ITP: an acquired platelet disorder caused by autoantibody-mediated clearance of the GPVI/FcR gamma-chain complex from the human platelet surface[J].Blood,2004,104(9): 1350-1355.

[29]Kazama F, Nakamura J, Osada M, et al. Measurement of soluble C-type lectin-like receptor 2 in human plasma[J]. Platlet,2015, 26(8): 711-719.

100853北京市,中国人民解放军总医院南楼心内科

R 543.31

Adoi:10.3969/j.issn.1003-9198.2016.03.004

2016-01-15)