南国梨多酚氧化酶的研究

何晓蒙，孔繁东（大连工业大学食品学院，辽宁大连116000）

南国梨多酚氧化酶的研究

何晓蒙，孔繁东*
（大连工业大学食品学院，辽宁大连116000）

以新鲜南国梨果实为原料，邻苯二酚为底物，采用分光光度法研究南国梨多酚氧化酶的酶学特性。结果表明：pH和温度对新鲜南国梨PPO活性有明显的影响，最适pH为6.8，新鲜南国梨PPO最适温度为40℃。进一步研究了抑制剂抗坏血酸、柠檬酸、亚硫酸氢钠、L-半胱氨酸、EDTA-2Na和各种金属盐 [CuSO4、CaCl2、Na2SO4、Al（NO3）3、CdCl2、HgCl2、MnCl2]对南国梨PPO的影响，其中0.1 mmol/L的抗坏血酸对新鲜南国梨PPO活性有明显抑制作用高达50%。南国梨PPO催化底物邻苯二酚的酶促反应动力学与米氏方程高度符合，R2=0.998，其动力学方程为1/[V]=0.002/[S]+0.019，最大反应速率Vmax为52.632 U/min，米氏常数Km为0.010 5 mol/L。

南国梨；多酚氧化酶；酶学特性

人们对多种植物中的多酚氧化酶已进行了广泛研究，但对南国梨果肉多酚氧化酶的一些生理生化特性报道却很少[1-4]。在南国梨的加工过程中，容易遭受酶促褐变的困扰，褐变后不仅影响外观品质，而且使其失去食用价值，因此，褐变是目前梨果类深加工过程中最待解决的一个问题[5]。南国梨中多酚氧化酶的活性很高[6-7]，而多酚氧化酶正是引起果蔬酶促褐变的主要原因，南国梨在加工贮藏时出现的机械损伤，不可避免的加快了褐变的产生[8-11]，通过对温度、pH、离子各条件和酶动力学方程的综合测定，试验出可以抑制多酚氧化酶的酶活性的最适条件，从而提高南国梨深加工的产品品质和营养价值，为接下来南国梨果酒的酿造研究提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料

南国梨：市售。

1.2仪器与试剂

1.2.1仪器

TL.18M高速离心机：科大创新股份有限公司；高速组织捣碎机：九阳股份有限公司；SHZ-3循环水真空泵上海奥克斯设备有限公司；BCD-215YH海尔冰箱：青岛海尔股份有限公司；WFJ7200可见光分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；磁力搅拌器：上海沪西分析仪器厂有限公司；GB303电子精密天平：梅特勒托利多仪器有限公司；TG328A型电光分析天平：上海天平仪器。

1.2.2主要试剂

丙酮、邻二苯酚、磷酸氢二钠、氢氧化钠、抗坏血酸、柠檬酸、亚硫酸氢钠、L-半胱氨酸、EDTA-2Na、Cu－SO4、CaCl2、Na2SO4、Al（NO3）3、CdCl2、HgCl2、MnCl2：北京化学试剂公司。

1.3方法

1.3.1多酚氧化酶（PPO）粗酶液的提取[12-13]

称取完好无色变的南国梨200 g，迅速切块，加入50 mL冷丙酮（-22℃）混合打浆，加入100 mL冷丙酮，充分搅拌后进行抽滤，讲滤渣溶于100 mL冷丙酮中，反复抽滤至滤渣为无色，滤渣在室温下干燥至恒重，加入100 mL磷酸盐缓冲液（pH=6.8）4℃搅拌30 min，将液体在8 000 r/min离心20 min，取上清液为粗提液，冷藏备用。

1.3.2PPO活性的测定[14-16]

以邻苯二酚为底物，加入缓冲液和酶液后，用紫外分光光度计检测反应液在420 nm处的吸光度值（A值），每隔5秒读取一次A值，依据曲线最初的直线部分计算酶活力。以在1 min内引起吸光度变化0.001为一个酶活力单位（U）。

1.3.3pH对PPO活性的影响[17]

反应液中加入不同pH的缓冲液进行反应，测定不同p H时的酶活。pH范围取4～8，温度25℃。反应液组成：酶液0.5 mL，邻苯二酚溶液1 mL（0.2 mol/L），磷酸缓冲液5 mL。

1.3.4温度对PPO活性的影响[18-19]

用恒温水浴锅调整不同的温度，使酶液和缓冲溶液处于不同的温度中反应一定时间，然后加入邻苯二酚底物液反应，检测酶活。温度范围取20℃～50℃，反应液组成：酶液0.5 mL，邻苯二酚溶液1 mL（0.2 mol/L），磷酸缓冲液5 mL。

1.3.5抑制剂及金属盐溶液对酶活性的影响[20-24]

用磷酸盐缓冲液配置不同浓度的抗坏血酸、柠檬酸、亚硫酸氢钠、L-半胱氨酸、EDTA-2Na和各种金属盐溶液（CuSO4、CaCl2、Na2SO4、Al（NO3）3、CdCl2、HgCl2、MnCl2）分别取上述溶液0.5 mL，酶液0.5 mL，邻苯二酚溶液1 mL（0.2 mol/L），磷酸缓冲液5 mL。在25℃条件下测定PPO的活性。

1.3.6酶反应动力学[25-27]

根据酶-底物中间复合物假说，单一底物酶促反应机制可表示为：E+S←→ES→E+P米氏方程为V= Vmax[S]/（Km+[S]），换为双倒数方程即为1/V=Km/Vmax×1/ [S]+1/Vmax，其中V为酶反应速度，Km为米氏常数，Vmax为最大反应速度，[S]为底物浓度。由双倒数作图，可计算出Km与Vmax。以邻苯二酚为底物，试验设计0.022、0.029、0.040、0.067、0.200 mol/L 5个不同浓度，其倒数分别对应为45、35、25、15、5 L/mol，酶反应动力学的研究在25℃、pH6.8条件下检测底物添加量不同时的酶的活性，做出底物浓度－酶活的曲线，并用双倒数作图法做LB曲线求出Vmax和Km值，做出米氏方程。

2　结果与讨论

2.1pH对酶活力的影响

pH对酶活力的影响见图1。

图1　pH对南国梨PPO活力的影响Fig.1　Effect ofpH on the activity of PPO from Nanguo pear

由图1可知，pH值对PPO活力的影响较大。当pH从3增加到5.5时，PPO活力剧烈上升，酶活力增长为原来2倍～3倍；随着pH从5.5增加到6.8，酶活力呈现缓慢上升，在pH6.8时达到最大；随后，随着pH 从6.8增加到8.0时，酶活力呈下降趋势，当pH8.0时，酶活力仅为pH6.8时的44.76%。可以看出，该南国梨PPO的最适pH值为6.8。

2.2温度对酶活力的影响

温度对酶活力的影响见图2。

由图2可知，南国梨PPO反应的最适温度为40℃。在10℃～40℃范围内，酶活力随着温度的升高而逐渐增强；但当温度继续上升到40℃以上时，酶活力开始迅速下降；当温度升高到70℃时，PPO基本失活，活力只有40℃时的15.625%。确定南国梨PPO最适温度为40℃。

图2　温度对南国梨PPO活力的影响Fig.2　Effectof temperature on the activity of PPO from Nanguo pear

2.3抑制剂及金属盐溶液对酶活性的影响

抑制剂及金属盐溶液对酶活力的影响见图3。

图3　抗坏血酸、柠檬酸、EDTA-2Na、Na2SO4（a），亚硫酸氢钠、L-半胱氨酸（b），CuSO4、CaCl2、Al（NO3）3（c），CdCl2、HgCl2、MnCl2（d）PPO活力的影响Fig．3　Effect of Ascorbic acid，citric acid，EDTA-2Na，Na2SO4（a），sodium bisulfite，L-cysteine（b），CuSO4，CaCl2，Al（NO3）3（c），CdCl2，HgCl2，MnCl2（d）on the activity of PPO from Nanguo pear

以抗坏血酸、柠檬酸、亚硫酸氢钠、L-半胱氨酸、Na2SO4、Na2SO4、EDTA-2Na等抑制剂和各种金属盐溶液[CuSO4、CaCl2、Al（NO3）3、CdCl2、HgCl2、MnCl2]作为效应物，研究抑制剂和Cu2+、Ca2+、Al3+、Cd2+、Hg2+、Mn2+对南国梨PPO活力的影响。在pH=6.8的磷酸缓冲液中，在40℃条件下，以邻苯二酚为底物测定酶的相对活力[28-29]。由图3 a和图3b可知，抗坏血酸在较低浓度时，对PPO的抑制作用高达50%，是所有抑制剂中效果最显著的。柠檬酸对PPO的作用并不明显，亚硫酸氢钠、L-半胱氨酸、EDTA-2Na、Na2SO4对PPO均有一定程度的抑制作用，并随着浓度增加抑制作用微量增强。由图3 c可知，Cu2+、Ca2+、Al3+对南国梨PPO没有影响或者说影响很微小。由图3d可知，Cd2+、Hg2+、Mn2+都可以将PPO激活约20%，但它们的激活程度不会很大。

2.4酶反应动力学

酶反应动力学直线见图4。

图4　南国梨PPO酶促反应的双倒数曲线Fig.4　Lineweaver-Burk plotof PPO in Nanguo

由图4可知，5个不同底物浓度拟合得到的直线方程为1/[V]=0.002/[S]+0.019，R2为0.998，该方为酶促反应动力学方程。从动力学方程上看，南国梨PPO催化邻苯二酚的反应与米氏方程非常吻合，表明南国梨PPO酶动力学方程符合米氏方程，通过米氏动力学方程求得该酶促反应的最大反应速率Vmax为52.632 U/min，米氏常数Km为0.010 5 mol/L。

3　结论

1）南国梨中含有大量的PPO，在榨汁加工过程中，极易快速发生酶促褐变反应，因此，加工过程中需有效抑制PPO活性来降低褐变速度。pH和温度对南国梨PPO活性有明显的影响，其最适pH为6.8，最适温度为40℃。在加工过程中，可通过调节pH和温度来降低南国梨PPO活性，减少褐变的发生。

2）抑制剂和金属离子对南国梨PPO均有不同影响，其中0.1 mmol/L的抗坏血酸对PPO的抑制作用最显著高达50%；2.5 mmol/L的Hg2+对PPO的激活能力最强，达到125.5%。

3）南国梨PPO催化底物邻苯二酚的酶促反应动力学与米氏方程高度符合，R2=0.998，其动力学方程为1/ [V]=0.0002/[S]+0.019，最大反应速率Vmax=52.632 U/min，米氏常数Km=0.010 5 mol/L。

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Research of Nanguo Pear Polyphenol Oxidase

HE Xiao-meng，KONG Fan-dong*（College of Food Science，Dalian Polytechnic University，Dalian 116000，Liaoning，China）

Fresh Nanguo pear as raw material，catechol as substrate，using spectrophotometric study of southern pear enzymatic characteristics of polyphenol oxidase.The results showed that：p H and temperature had a significant effect on fresh Nanguo pear PPO activity and the optimum pH was 6.8，fresh pear PPO optimum temperature was 40℃.Further study of the inhibitor of ascorbic acid，citric acid，sodium bisulfite，L-cysteine，EDTA-2Na and various metal salts[CuSO4，CaCl2，Na2SO4，Al（NO3）3，CdCl2，HgCl2，MnCl2]effectof southern pear PPO，where 0.1 mmol/L of ascorbic acid on fresh pear PPO activity was sign if icantly inhibited by up to 50%.Nanguo pear PPO enzymatic catalytic substrate catechol reaction kinetics and the Michaelis-Menten equation height accord，R2=0.998，its kinetic equation 1/[V]=0.002/[S]+0.019，maximum reaction rate Vmaxto 52.632 U/min，the Michaelis constant Kmof0.010 5 mol/L.

Nanguo pear；polyphenoloxidase；enzymatic characterization

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.008

何晓蒙（1990—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品生物技术。

孔繁东（1958—），男（汉），教授，研究方向：蛋白质资源开发利用。

2015-05-28