TTN、ALK、MUC2高频变异位点与胃癌临床病理特征的相关性

王珍珍，王公平，张 伟，裴 哲

TTN、ALK、MUC2高频变异位点与胃癌临床病理特征的相关性

王珍珍，王公平，张 伟，裴 哲

目的 研究胃癌的高频变异位点并探讨其与胃癌临床病理特征的关系。方法 通过二代测序平台对26例胃癌组织进行靶向深度测序，与人类基因组UCSC hg19数据库比对，筛选出胃癌中的高频变异位点，并对临床病理特征进行分析。结果 胃癌中突变率较高的基因位点有TTNrs12693166 (15/26) 、rs2627043 (22/26) ，ALKrs3795850 (19/26) 、rs1881420 (23/26) ，MUC2 rs2856111(20/26) 、rs56365200 (20/26)。高频变异位点与胃癌的年龄、性别、分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期以及劳伦斯分型等临床病理特征之间差异无统计学意义。结论TTNrs12693166、rs2627043、ALKrs3795850、rs1881420、MUC2 rs2856111、rs56365200位点在胃癌中变异频率较高，可能与胃癌的发生存在一定的相关性。未发现高频变异位点与胃癌患者的临床病理特征存在明显的相关性。

胃癌；测序分析；高频变异位点；临床病理特征

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率居全球第四位，在癌症引起的死亡中致死率居第二位[1]。在中国，男性胃癌发病率居第二位，死亡率居第三位；女性胃癌发病率居第四位，死亡率居第二位，严重影响人们的生命健康和生活质量[2]。胃癌的发生是一个多因素、多环节、多个基因共同参与的复杂过程。其中，关于胃癌基因检测的研究已成为国内外胃癌研究的一个热点，并且已取得了一定的进展[3]。随着二代测序技术的出现，可以对癌症中基因组、转录组及外显子组进行更全面的深度测序，为对癌症更精确地诊断和分类、进行个体化治疗、合理预后评估及靶向抗癌药物的研发提供一定的参考[4]。

本研究通过二代测序平台对26例胃癌组织进行靶向深度测序，通过与人类基因组UCSC hg19数据库的比对，筛选胃癌患者中变异基因，探讨高频变异位点在胃癌中的临床病理意义，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 ―般资料 收集2013年4月至9月在河南科技大学第一附属医院胃肠肿瘤外科住院进行手术的胃癌患者术后标本，-80 ℃超低温冰箱保存。入选患者术前均未经过放疗或化疗，术前由胃镜及活检组织病理诊断，并且术后病理检验确认。胃癌临床病理分期依据美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)胃癌TNM分期标准[5]进行分期。26例胃癌患者的中位年龄为58.5岁(39～78岁)，其中男性19例(73.1%)，女性7例(26.9%)；高分化5例，中分化7例，低分化14例；淋巴结转移者20例，无淋巴结转移者6例。本研究经河南科技大学第一附属医院伦理委员会许可，采样患者均知情同意。

1.2 测序实验步骤如下

1.2.1 样本制备 冷冻的肿瘤组织用QIAGEN公司的基因组DNA提取试剂盒，按照说明书进行DNA的提取后定量备用。

1.2.2 文库构建 将基因组DNA通过超声波随机打断成长度为数十至数百碱基的片段，在这些片段的两端添加上不同的接头，通过变性得到单链模板文库，然后再通过接头固定在相应的固定相上。

1.2.3 测序反应 DNA测序运用Illumina公司Hiseq 2500进行测序，向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP。这些dNTP的3’-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。加入激发荧光所需的缓冲液后，激光激发荧光信号，并由光学设备完成荧光信号的记录，利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。荧光信号记录完成后，淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以便进行下一轮的测序反应。

1.2.4 数据分析 首先将原始数据进行过滤，过滤掉含有接头及低质量的读长，得到有效数据。将有效数据通过伯罗斯—惠勒变换(Burrows-Wheeler Aligner，BWA)方法比对到参考基因组(UCSC hg19)，得到最初比对结果。再用Picard和GATK软件进行去重复、局部重对比、碱基质量值校正等处理，得到最终的比对结果。用GATK的Unified Genotyper模块进行SNV/InDel检测。临床病理资料的统计分析：运用SPSS 21.0统计软件，采用Fisher精确概率法对高频变异位点与胃癌临床病理特征进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 测序发现的高频变异位点 经过筛选过滤发现，突变率较高的基因位点有TTNrs12693166 (15/26)、TTNrs2627043 (22/26)、ALKrs3795850 (19/26)、ALKrs1881420 (23/26)、MUC2 rs2856111(20/26)、MUC2 rs56365200 (20/26)，详见图1。

图1 胃癌中的高频变异位点分布

2.2 高频变异位点与胃癌临床病理特征的相关性TTNrs12693166、rs2627043，ALKrs3795850、rs1881420，MUC2 rs2856111、rs56365200位点的变异与胃癌患者的年龄、性别、分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期以及劳伦斯分型之间均无统计学意义(均P>0.05)，详见表1。

表1 TTN、ALK、MUG2变异位点与胃癌临床病理特征的关系(n=26) 例

(续表)

临床特征TTNrs12693166TTNrs2627043ALKrs3795850ALKrs1881420MUC2rs2856111MUC2rs56365200变异未变异变异未变异变异未变异变异未变异变异未变异变异未变异性别 男127172145163154136 女345252705270分化程度 高分化233241503250 中分化527043706161 低分化8612211311311395浸润深度 T1/T2526152704370 T3/T4109163145163163136淋巴结转移 有119182155173164155 无424242604251TNM分期 Ⅰ/Ⅱ738264917391 Ⅲ/Ⅳ88142133142133115劳伦斯分型 弥散型104131122113122113 混合型223131402222 肠型356244806271

注：P<0.05，有统计学意义。

3 讨论

目前，胃癌基因检测的研究已成为国内外胃癌研究的热点之一，并且已取得了一定的进展。与第一代测序技术相比，二代测序技术因其高通量、快速、低成本的优点，保持了较高的准确度，加快了测序速度，很大程度上降低了测序的成本，在基因组学研究中已得到广泛应用[6]。二代测序能够系统地检测肿瘤基因组中的基因变异，并发现新的基因变异[7]。运用二代测序发现与肿瘤相关的基因变异能够为肿瘤发病风险预测、早期诊断、效果评估、个体化医疗的发展提供一定的理论基础，为人们进一步了解肿瘤发病机制、筛选有效的肿瘤标记物以及对基因组学的深入研究提供了有效途径[8]。

通过二代测序技术发现本研究中的26例胃癌组织中，TTN基因、ALK基因以及MUC2基因突变率较高，而突变率较高的基因位点有TTNrs12693166 (15/26)、TTNrs2627043 (22/26)、ALKrs3795850 (19/26)、ALKrs1881420 (23/26)、MUC2 rs2856111(20/26)、MUC2 rs56365200 (20/26)。TTN基因编码肌联蛋白，负责调节肌肉的被动弹性，在心肌和骨骼肌的发育、结构形成、功能调节中发挥关键作用，与肌动蛋白和肌球蛋白共同构成了人体心肌和骨骼肌的重要组成部分[9]。Pföhler等[10]研究发现TTN作为存在于黑色素瘤相关性视网膜病患者的血清抗体中的抗原，是黑色素瘤潜在的生物标记，可能具有致癌作用。ALK基因编码间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶，作为核仁磷酸蛋白的融合伴侣首次发现于间变性大细胞淋巴瘤[11]。Chou等[12]发现2.2%的乳头状甲状腺癌中存在ALK基因的易位，并且ALK基因的重排可能与乳头状甲状腺癌的弥漫性硬化相关。Demeure等[13]发现在乳头状甲状腺癌中ALK和EML4的融合可导致ALK的连续性激活，形成肿瘤生长及存活的通路，是肿瘤发生过程中的驱动事件。

Lee等[14]运用荧光原位杂交技术以及二代测序技术检测了ALK在结直肠癌中的重排，发现ALK重排是结直肠癌中潜在的活化驱动变异。MUC2基因能够编码黏蛋白，其主要表达于黏膜上皮，属于黏膜防御机制的一道屏障。MUC2基因水平的变化可能会导致黏蛋白表达的异常，从而导致一系列病理生理变化。Marín等[15]研究发现MUC2的基因变异与胃癌前病变，特别是携带有幽门螺杆菌感染的患者，存在明显相关性。正常胃黏膜很少或不表达MUC2，当肠化生或者胃癌时MUC2的表达水平明显增加[16-17]。MUC2可能是在幽门螺杆菌感染后由促炎因子的表达所激活，从而导致MUC2的过量表达[18]。因此，TTN、ALK、MUC2可能存在与胃癌相关的基因变异，这些位点可能与胃癌的发生、发展存在一定的联系。

然而，将这些高频突变位点与胃癌临床病理特征进行分析，并未发现这些位点的变异与胃癌患者的年龄、性别、分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期以及劳伦斯分型等临床病理特征存在明显的相关性。鉴于本研究样本量较少，这些高频变异与胃癌发生发展的相关性有待于进一步证实。

综上，TTNrs12693166、rs2627043、ALKrs3795850、rs1881420、MUC2 rs2856111、rs56365200位点在胃癌中变异频率较高，可能与胃癌的发生存在一定的相关性。本研究未发现这些变异位点与胃癌患者的临床病理特征存在明显的相关性，尚需进一步大样本研究证实。

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Correlation betweenTTN,ALK,MUC2 Recurrent Mutation Sites and Clinicopathologic Characteristics in Gastric Cancer

WANG Zhen-zhen, WANG Gong-ping, ZHANG Wei, PEI Zhe

(College of Clinical Medicine, First Affiliated Hospital,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

ObjectiveTo study the recurrent mutation sites in gastric cancer and explore its relation to clinicopathologic significance of gastric cancer.MethodsNew generation sequencing was applied to 26 cases of gastric cancer tissues by the targeted deep sequencing. The sequencing data were compared with UCSC hg19 database, and the recurrent mutation sites were screened and analyzed with the clinicopathologic features of gastric cancer.ResultsThe recurrent mutation sites in gastric cancer wereTTNrs12693166(15/26),TTNrs2627043(22/26),ALKrs3795850(19/26),ALKrs1881420(23/26),MUC2 rs2856111(20/26),MUC2 rs56365200(20/26). There were no statistical significance between these recurrent mutation sites and the clinicopathological features in patients with gastric cancer.ConclusionThe recurrent mutation sites (TTNrs12693166, rs2627043,ALKrs3795850, rs1881420,MUC2 rs2856111, rs56365200) might be correlated with the carcinogenesis of gastric cancer. No significant association were found between these recurrent mutation sites and the clinicopathological features in patients with gastric cancer.

gastric cancer；sequencing analysis；recurrent mutation sites； clinicopathological characteristics

1672-688X(2016)04-0255-04

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.04.005

2016-05-17

河南科技大学临床医学院，河南科技大学第一附属医院，河南洛阳 471003

王珍珍(1989- )，女，河南平顶山人，从事胃癌的基础研究与临床治疗工作。

王公平，男，博士，教授，E-mail：wgpnw@126.com

R735.2

A