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miR-146a和miR-146b在卵巢癌的表达及其临床意义

2016-08-23刘志惠

食管疾病 2016年4期
关键词:卵巢癌试剂盒引物

刘志惠,刘 平

miR-146a和miR-146b在卵巢癌的表达及其临床意义

刘志惠,刘 平

目的 探讨miR-146a和miR-146b在卵巢癌癌组织及配对的癌旁组织中的表达,及其与临床病理特征的相关性。方法 收集2013年1月至2015年10月我院38例卵巢癌和配对的癌旁组织,运用RT-PCR的方法检测38对卵巢癌癌组织及其癌旁组织miR-146a和miR-146b的表达,分析其与卵巢癌临床病理特征的相关性及其临床意义。结果 荧光定量PCR显示卵巢癌癌组织中miR-146a和miR-146b的平均表达量(6.74±2.74)和(6.34±2.14)比癌旁组织的平均表达量(7.08±1.70)和(7.26±2.59)明显下调(均P<0.05)。miR-146a和miR-146b的表达与卵巢癌淋巴结转移之间存在负相关(均P<0.05)。结论 miR-146a和miR-146b的表达下调在卵巢癌的发生发展中可能发挥重要的作用。

卵巢癌;miR-146a;miR-146b;临床分期;淋巴结转移

与癌症相关的女性死亡病例中,卵巢癌排在第五位。大约80%的卵巢癌发现时已是晚期,其中大多数患者存活时间不超过5 a[1]。临床上经常使用的CA125、CEA等肿瘤标记物敏感性、特异性较差,对卵巢癌的早期诊断帮助不大[1]。近年来由于对miRNA认识的不断深入,其中在卵巢肿瘤的研究领域miRNA与卵巢癌关系的研究,包括卵巢癌的发病机制、早期诊断、治疗、化疗耐药、预后判断等诸多方面[2]。本研究探讨miR-146a和miR-146b在卵巢癌的表达及其与临床病理特征的相关性,报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料1.1.1 样本和临床病理资料的收集 收集2013年1月至2015年10月南阳市第二人民医院妇科接受根治性卵巢切除术和盆腔淋巴结清扫的38例卵巢癌患者,年龄38~76岁,中位数53.2岁。根据国际妇产科联合会(Federation International of Gynecology and Obstetrics, FIGO)的诊断标准,38例卵巢癌病例中24例为Ⅰ期患者,14例Ⅱ期患者;15例有淋巴结转移,23例无淋巴结转移;透明细胞癌3例,浆液性癌32例,子宫内膜样癌3例。13例分化良好(GradeⅠ级,G1),18例中度分化(Grade Ⅱ级,G2),7例低分化(Grade Ⅲ级,G3)。所有患者术前均未接受化疗或放疗;所有病例均有病理组织学诊断支持;所有标本都于手术取材后第一时间储存在-80 ℃条件下。

1.1.2 试剂与仪器 miRNeasy提取试剂盒(Qiagen,美国),miRNA逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(诺维赞生物公司,南京),Biotek Epoch微量核酸定量仪购自美国Biotek公司,7500荧光定量PCR仪购自ABI 公司。

1.1.3 RT-PCR检测基因 miRNA-146a和miRNA-146b的引物序列通过PCR引物设计软件Primer Premier 5.0设计has-miR-146a、has-miR-146b和U6的引物序列,具体序列如下:has-miR-146a-5p:5′-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3′,has-miR-146b-5p:5′-UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU-3′,U6:5′-GCTTCGGC AGCACATATACTAAA-3′,并由Life Technologies公司合成。引物干粉离心后用DEPC水配制成20 μmol·L-1,置于-20 ℃冰箱备用。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取和反转录 使用miRNeasy提取试剂盒对癌组织及癌旁组织中的microRNA进行提取。运用分光光度法对RNA 进行定量。按照Genecopoeia公司的miRNA逆转录试剂盒说明书对miRNA进行反转录,反转录反应由1 μg的总RNA,与10 μL 2×RT mix,2 μL mix,1 μL oligod NTPs,1 μL Random hexamers,总体系20 μL。 25 ℃ 5 min,50 ℃ 15 min,85 ℃ 5 min,经逆转录形成cDNA。

1.2.2 RT-PCR检测miRNA-146a和miRNA-146b

使用Taqman miRNA探针对miR-146a-5p and miR-146b-5p进行检测,具体操作步骤按照操作说明进行,以2-ΔΔCt表示基因的相对表达水平。实时PCR体系为 20 μL,包含2 μL反向转录产物,引物2 μL,反向引物2 μL,2×mix 10 μL,去RNA酶的纯水4 μL。1个循环包括95 ℃30 s、95 ℃5 s和60 ℃30 s,总共40个循环。所有样本均设3个复孔。

2 结果

2.1 miRNA-146a和miRNA-146b的表达 卵巢癌组织中miRNA-146a和miRNA-146b的平均表达量为(6.74±2.74)和(6.34±2.14),低于卵巢癌癌旁组织中miRNA-146a和miRNA-146b的平均表达量(7.08±1.70)和(7.26±2.59),差异有统计学意义(t=2.189,P=0.036;t=2.535,P=0.016),见图1。

A:miR-146a表达量 B:miR-146b表达量图1 miR-146a和miR-146b实时荧光定量PCR结果

2.2 二者临床病理特征的相关性 肿瘤组织中有淋巴结转移miRNA-146a和miRNA-146b表达水平越低。miRNA-146a与临床分期亦呈负相关(P=0.039),即临床分期越差,miRNA-146表达水平越低,见表1。

表1 miR-146a和miR-146b的表达与卵巢癌临床病理特征的相关性

3 讨论

miRNA通过调控肿瘤相关基因的表达控制肿瘤细胞的生长发育、凋亡、增殖、血管形成、侵袭迁移等生物学过程,从而调控多种肿瘤的发生发展[3-4]。在卵巢癌的发生发展过程中miRNA亦扮演着重要的角色。Iorio等[5]发现,不同的卵巢癌组织学类型、脉管浸润等病理特征决定着miRNA的表达谱。如在透明细胞癌、浆液性癌和子宫内膜样癌中miR-200a和miR-200c均呈高表达,而在浆液性和子宫内膜样癌中miR-141和miR-200b呈高表达。因此,miRNA对于鉴别正常卵巢组织与癌变卵巢组织有帮助,甚至可以区分癌的组织学类型。

研究发现在p53活性受抑制鼠的卵巢上皮中miR-34b和miR-34c表达水平明显下调[6-7],基因测序发现在miRNA编码区上游处存在p53的结合位点;随后对人的p53阴性卵巢癌癌细胞进行分析发现miR-34b和miR-34c表达水平下调;用多柔比星处理野生型p53阳性卵巢癌癌细胞,由此推测在卵巢癌发生发展中miR-34家族具有类似抑癌基因的作用。本研究显示卵巢癌癌组织中miR-146a和miR-146b的平均表达量(6.74±2.74)和(6.34±2.14),比癌旁组织的平均表达量(7.08±1.70)和(7.26±2.59)明显下调(均P<0.05),提示miR-146a和miR-146b的表达下调可能在卵巢癌的发生发展中发挥作用。

不同的miRNA可通过不同作用机制对卵巢癌的发展产生促进或抑制作用。有研究发现miR-200通过抑制肿瘤血管形成、上调钙黏蛋白的表达等两个方面抑制肿瘤转移[8-10]。Chen 等[11]研究发现,在卵巢癌细胞中miR-429过表达,可逆转间叶组织向上皮组织过渡,进而促进卵巢癌转移。有研究发现miR-200c 高表达的患者,2 a生存率显著升高,与之相反miR-141低表达的人群,2 a生存率显著升高,提示miR-200c和miR-141可作为生物标记物判断卵巢癌的预后[12]。本研究中肿瘤组织中miRNA-146a和miRNA-146b的表达水平与有无淋巴结转移有负相关性,即有淋巴结转移miRNA-146a和miRNA-146b表达水平越低。

此外,miRNA还参与卵巢癌的化疗耐药过程。Boren等[13]证实27个miRNA与卵巢癌化疗耐药有关。Weiner-Gorzel等[14]发现卵巢癌细胞对紫杉醇化疗耐药与miR-433表达上调有关。研究发现miR-146a可以通过促炎细胞因子干扰胰岛素分泌[15],而且诱导miR-146a表达会导致β细胞程序性死亡的增加[16]。目前研究表明miR-146a/b的抑癌作用与其调控NF-κB通路的活性有关,转染miR-146a/b的MDAMB-231细胞中的表达量明显下调,其下游基因表达水平亦下降,这些基因对细胞的侵袭转移功能有调控作用[17]。

总之,本研究发现卵巢癌中miR-146a和miR-146b的表达比癌旁组织呈明显下调,miR-146a和miR-146b的表达与卵巢癌淋巴结转移之间存在负相关,说明miR-146a和miR-146b的表达可能在卵巢癌的发生发展中发挥重要作用。

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Expression of miR-146a and miR-146b in Ovarian Cancer and its Clinical Significance

LIU Zhi-hui, LIU Ping

(Second People′s Hospital of Nanyang,Nanyang 473000,China)

ObjectiveInvestigating the expression of miR-146a and miR-146b in ovarian cancer and adjacent non-cancerous tissuesand its correlation with clinicopathologic characteristics.Methods38 cases of ovarian cancer tissues and and adjacent non-cancerous tissues were collected in our hospital from January 2013 to October 2015.RT-PCR was used to detect the expressions of miR-146a and miR-146bin 38 pairs ovarian cancer tissues and adjacent non-cancerous tissues, the correlation with clinical pathologic parameters and clinical significance were analyzed also.ResultsThe average expression of miR-146a and miR-146b was significantly down-regulated in ovarian cancer tissues compared with the adjacent non-cancerous tissues(6.74±2.74) VS (7.08±1.70), (6.33±2.14) VS (7.26±2.59), respectively (allP<0.05). There were significantly negative correlation between the expression of miR-146a and miR-146b and lymph node metastasis (allP<0.05).ConclusionmiR-146a and miR-146b may play an important role in the tumorigenesis and tumor progression of ovarian cancer.

ovarian cancer;miR-146a;miR-146b;clinical stage;lymphnode metastasis

1672-688X(2016)04-0252-03

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.04.004

2016-07-12

南阳市第二人民医院,河南南阳 473000

刘志惠(1980-),女,回族,河南南阳人,医师,从事妇产科临床、科研工作。

R737.31

A

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