云南省2005-2012年91株甲型副伤寒沙门菌病原学特征分析

陈玉娟,尹建雯,古文鹏,李超群,杨建斌,徐 闻,伏晓庆

云南省是伤寒副伤寒的高发地区之一，近年来发病率及发病数均居全国首位。而玉溪市、红河州和德宏州,尤其玉溪市是云南省伤寒副伤寒的高发地区。近年来，云南省的发病情况以副伤寒为主，特别是甲型副伤寒逐渐成为了优势菌株。其中又以玉溪市的甲型副伤寒发病最为严重。我们通过对云南省2005-2012年8年间监测的91株甲型副伤寒沙门菌进行病原学特征分析，从菌株的耐药性和分子分型角度揭示云南省甲型副伤寒的流行规律和特点，为制定有针对性的防治措施提出依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源 91株甲型副伤寒沙门菌均为2005-2012年间分离得到的菌株，其中玉溪市72株，红河州14株，见表1。

表1 云南省2005-2012年 91株甲型副伤寒沙门菌菌株分布情况

1.2主要仪器 脉冲场凝胶电泳仪(Bio-Rad CHEF Mapper)，凝胶成像仪(Bio-Rad GEL Doc2000)。

1.3试剂XbaI和SpeI限制性内切酶购自日本TaKaRa公司；SeaKem Gold Agarose购自美国 Cambraex Bio Rockland公司；药敏纸片均购于英国OXOID公司，按规定贮存并在有效期内使用；M-H琼脂，购于北京陆桥生物科技公司。

1.4方法

1.4.1药敏试验 采用K-B纸片法进行，药敏试验结果判断根据按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)微生物敏感试验[1]执行，试验质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。根据《全国伤寒副伤寒监测方案》中提及的抗生素药物进行药敏试验，主要选取10种抗生素，分别是：氨苄西林(AMP)、阿莫西林/棒酸(AMC)、头孢噻吩(CFT)、头孢噻肟(CTX)、庆大霉素(GEN)、萘啶酸(NAL)、环丙沙星(CIP)、四环素(TBT)、利福平(RFA)和复方新诺明(SMZ)。

1.4.2脉冲场凝胶电泳(PFGE) 具体操作过程见参考文献[2]，并按PulseNet公布的沙门菌PFGE标准过程进行操作和参数设置(Auto Algorithm：30 kb-low MW，700 kb-high MW，电泳时间为19 h)，每块胶酶的用量为XbaI 45 U，SpeI 30 U(具有相同的XbaI酶切带型的菌株再用SpeI进行酶切)，37 ℃分别酶切2 h。电泳结束后用Gelred核酸染料染色30 min，纯水脱色30 min，凝胶成像仪上读取图像。

1.4.3聚类分析 聚类分析采用BioNumerics V5.10软件进行聚类分析，应用非加权组平均法(UPGMA)，聚类相似性系数采用基于条带比较的Dice。Dice=2×N/(N+M)，N表示能匹配的条带个数，M表示所有的条带个数(2株菌带型上的条带数总和再减去匹配的条带数)。

2 结 果

2.1药敏试验结果 2005-2012年间监测的91株甲型副伤寒沙门菌株均对萘啶酸和利福平耐药，而对阿莫西林/棒酸、头孢噻吩、头孢噻肟、庆大霉素、环丙沙星敏感；多重耐药菌株则较少出现。各年间菌株的敏感性之间存在差异(χ2=58.414,P<0.01),表明近年来甲型副伤寒菌株对药物的敏感性有所增加，见表2。

各地区菌株耐药情况不尽相同，表现为玉溪市72株甲型副伤寒沙门菌株对萘啶酸和利福平耐药，对阿莫西林/棒酸、头孢噻吩、头孢噻肟、庆大霉素、环丙沙星敏感；而红河州的14株甲型副伤寒沙门菌株对萘啶酸、四环素、利福平耐药；而对阿莫西林/棒酸、头孢噻吩、头孢噻肟、庆大霉素、环丙沙星敏感；德宏州的3株甲型副伤寒沙门菌对氨苄西林、萘啶酸、四环素、利福平药，表现为多重耐药；昆明市和曲靖市的各一株菌株也表现为多重耐药，见表3。

2.2PFGE结果 91株甲型副伤寒沙门菌的XbaI酶切带型主要分为两个大的聚类群，如图1所示。从图中可以看出，云南省的玉溪市为甲型副伤寒的高发地区之一，并且不同年份的分离菌株具有相同的XbaI酶切带型。除玉溪外，云南省的红河、德宏等地区的分离菌株与玉溪的菌株也具有相同的XbaI酶切带型。其中，2006-5是一株分离自曲靖市陆良县的暴发疫情菌株，其带型与监测菌株具有较高的同源性关系，二者的相似度为96.5%。而2005-1是从健康体检中分离出的一株甲型副伤寒沙门菌，其带型与玉溪、红河等地区的监测菌株一致。

表2 云南省2005-2012年91株甲型副伤寒沙门菌各年药敏结果

Note: * means Resistant; # means Intermediate; & means Susceptible.

表3 云南省2005-2012年各地区甲型副伤寒沙门菌株耐药情况

Note: * means Resistant; # means Intermediate; & means Susceptible.

我们选取部分具有相同XbaI酶切带型的代表性菌株用SpeI再次进行PFGE电泳，以确认菌株之间的同源性关系，如图2所示。结果表明，双酶切后菌株的分布关系与XbaI单个酶切的关系相一致，同样分为了两个聚类群，不同地区、年份的分离菌株双酶切带型具有一致性。

3 讨 论

伤寒副伤寒是国家乙类法定传染病。近年来，随着经济和社会的发展，全国以及云南省的伤寒副伤寒发病率呈逐年下降趋势，但云南省的发病情况与全国相比位居首位，已成为云南省重要的公共卫生问题。2011年全国7个省13个伤寒副伤寒监测点中，云南省占2个。2011年《中国重点传染病和病媒生物监测报告》显示，云南省勐海县、云南省红塔区的发病率最高(分别为48.67/10万和49.42/10万)。

以往由伤寒沙门菌引起的伤寒发病率较高，但近些年来，甲型副伤寒在全球的一些国家，如中国[3]、印度[4]、尼泊尔[5]、巴基斯坦[6]、台湾[7]等地发病率逐年上升[8]，尤其是中国的一些地区[9]，副伤寒的发病率已经超过了伤寒的发病率。

北美、欧洲尤其是东南亚地区近年甲型副伤寒暴发流行，故甲型副伤寒被列为近年重要的再发传染病[10-14]。副伤寒的发病主要在东南亚地区，发病数约占到了所有伤寒病例的50%[15-17]，印度、新加坡从1996年，日本2000年出现了甲型副伤寒暴发[18-19]。中国从1998、1999年先后，在贵州、浙江、广西、广东等省都出现多起甲型副伤寒的暴发，在部分伤寒的传统疫区甚至取代伤寒而成为优势菌型[20]。

图12005-2012年云南省91株甲型副伤寒沙门菌PFGE-XbaI酶切结果

Fig.1DistributiononPFGEpatternsof91SalmonellaparatyphiAstrainsisolatedinYunnanProvincedigestedbyXbaI,2005-2012

图2XbaI和SpeI双酶切带型相同的菌株PFGE结果

Fig.2DoubleenzymedigestionofXbaIandSpeIonthesamestrainpatternsofPFGE

近年来云南省成为全国甲型副伤寒沙门菌流行的高发地区，而玉溪市又是云南省副伤寒主要流行的地区。1999年以来，玉溪市是中国最严重的甲型副伤寒疫病区[21]。

对91株甲型副伤寒沙门菌的药敏试验结果分析发现，云南省的甲型副伤寒沙门菌对萘啶酸和利福平耐药，而对阿莫西林/棒酸、头孢噻吩、头孢噻肟、庆大霉素、环丙沙星敏感；仅有较少数量的菌株出现多重耐药情况。张莹[22]等对2006-2008年云南省伤寒、副伤寒监测点(红塔区和澄江县)分离的部分甲型副伤寒菌株进行药敏试验，结果显示甲型副伤寒对氨苄西林、阿莫西林、庆大霉素等大多数抗生素普遍敏感，对利福平、萘啶酸耐药，与本研究的结果一致。

脉冲场凝胶电泳分型技术具有对细菌整个染色体进行分析，重复性好，区分能力强，结果稳定且更易解释，被推荐为多种致病菌分型的金标准[23]。而用XbaI 酶切的甲型副伤寒PFGE 分辨率最高，具有最大区分能力的电泳参数,XbaI PFGE在显示多个克隆变异方面有较高的分辨力[24-25]，而SpeI PFGE 是把真正克隆区分开来的一种坚实手段并能用于检测克隆内的微进化[26]。

从91株甲型副伤寒沙门菌的PFGE结果可以看出云南省的副伤寒形成了两个高度分化的克隆群菌株。李伟[2]等的研究发现，甲型副伤寒大部分属于高度相似的克隆系，在不同省份、不同年代广泛存在。张雯霞[27]等的研究也发现甲型副伤寒间有较高的同源性。伏晓庆[28]等对国家伤寒副伤寒防治示范基地项目获得的玉溪市212株甲型副伤寒用XbaI进行酶切，发现其变异不大，有可能是同一克隆系的甲型副伤寒沙门菌。本研究结果进一步证实了甲型副伤寒沙门菌变异性不大等特点。

2008-2010年，中国疾病预防控制中心在云南省玉溪市开展伤寒副伤寒防治示范基地项目，通过建立基于全人群的发热症状监测系统，开展伤寒副伤寒病例对照调查和实施综合干预措施，使该地区发病水平得到一定控制。但从本研究的结果仍然可以看出，云南省玉溪市仍然存在甲型副伤寒的流行。而且从PFGE的结果可以推断云南省不同地区的甲型副伤寒流行可能具有相似的传播途径的特点，可能是由某个区域的菌株不断扩散传播出去，形成了两个高度分化的克隆群菌株[29]，从各地监测菌株的分子分型结果可以看出这一点。基于这些研究结果，我们认为目前云南省伤寒副伤寒菌株的传播途径和机制仍然还未得到有效控制，还需针对伤寒副伤寒高发地区进行高危因素防控工作。

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