绿色环保型可食用果蔬保鲜剂SA-cys的合成

刘 意，张栩琳，郑传进，李健乐，丰 伟（. 广东药学院医药化工学院，广东省中山市 58458；. 广东药学院食品科学学院，广东省中山市 58458）

绿色环保型可食用果蔬保鲜剂SA-cys的合成

刘 意1，张栩琳2，郑传进2，李健乐1，丰 伟1
（1. 广东药学院医药化工学院，广东省中山市 528458；2. 广东药学院食品科学学院，广东省中山市 528458）

利用海藻多糖（SA）良好的成膜保水性和L-半胱氨酸（L-cys）良好的抑菌、抗氧化性，通过化学改性法制备了巯基含量高达328.27 μmol/g的L-cys改性SA（SA-cys）。采用稀释平板计数法的研究表明：在被测试范围内，L-cys对革兰氏阴性大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、革兰氏阳性金黄色葡萄球菌均有很好的抑菌性；SA-cys对革兰氏阴性大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌均有较好的抑菌效果，最大抑菌率分别为100.00%，77.24%，对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的最大抑菌率只有61.26%；而SA对3种菌株的最大抑菌率均在40.75%以下，抑菌效果最差。因此，SA-cys在很大程度上综合了L-cys和SA的优势，拓展了SA在果蔬保鲜领域的应用范围。

改性海藻多糖 保鲜剂 鲜切水果 抗菌性能

海藻多糖（SA）是一种源自海带、海藻的天然链锁状高相对分子质量的多糖型聚合物，因具有优良的保湿性、成膜性而广泛应用于食品、化妆品和医药行业。将SA作为保鲜剂涂覆在新鲜果蔬表面，可形成对气体选择性透过的薄膜，阻止部分气体的交换，提供一个膜内具有较低O2、较高CO2浓度的微气调环境，进而降低细胞呼吸强度和营养物质的消耗，达到保鲜目的［1］；同时，SA还具有无毒无味、可生物降解、生物相容性好等诸多优点［2-4］；但纯SA型果蔬保鲜剂存在容易霉变，抗菌性能差等不足。因此，在高档果蔬贮藏、鲜切水果保鲜等领域，开发绿色环保型可食用保鲜剂已逐渐成为被广泛关注的研究热点［5-9］。

L-半胱氨酸（L-cys）是一种具有生理功能且在生物体内广泛存在的重要物质，在动、植物体内能够起到防御有害物质和增加活力的作用。早在20世纪80年代，世界各国已将其广泛应用于食品、药物和化妆品中［10］；但由于L-cys为氨基酸类小分子物质，其水溶液涂在水果表面不能形成保护膜，所以虽然有很好的抑菌性能，却无法直接作保鲜剂使用，只能用作某些保鲜剂的添加剂，若直接添加到SA中，会影响SA膜的综合性能（如透明性、力学强度等会明显降低）。研究发现：由于L-cys分子中含有还原性的巯基，或由于氧化后可形成二硫键等因素，L-cys除了能抑制水果的酶促褐变现象，可用于研究苹果汁的防褐变［11-14］，还有一定抑菌作用，对革兰氏阴性大肠杆菌、革兰氏阳性金黄色葡萄球菌均有很强的抑菌作用［15-16］；改性L-cys对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌及革兰氏阴性大肠杆菌均有抑制作用。因此，通过改性，在成膜物质中引入巯基，对于鲜切水果的保鲜具有重大意义［17-18］。

本文基于天然SA的巯基化改性，试图综合SA 和L-cys的优势，研制绿色环保型可食用果蔬保鲜剂——L-cys改性SA（SA-cys），并通过抗菌实验，为其在鲜切水果保鲜领域的应用提供参考。

1 实验部分

1.1 主要原料及仪器

L-cys，1-乙基-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDAC），无水乙醇：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产。无水碳酸钠，NaCl， HCl溶液，氢氧化钠粒状固体，碘，碘化钾，重铬酸钾，硫代硫酸钠：均为分析纯，天津市福晨化学试剂厂生产。SA，可溶性淀粉，胰蛋白胨，琼脂粉，酵母浸膏：均为食品级，成都市科龙化工试剂厂生产。MW4000型透析袋，截量4 000 Da，广州市齐云生物技术有限公司生产。革兰氏阴性大肠杆菌，革兰氏阳性金黄色葡萄球菌，蜡样芽孢杆菌：均为广东药学院食品学院微生物实验室提供。

Perkin-Elmer 240Q型傅里叶变换红外光谱仪，美国PE公司生产；U-3900型紫外可见光分光光度计，日本日立公司生产；LGT-10C型冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂有限公司生产；SMART系列生物显微镜，重庆奥特光学仪器有限责任公司生产。

1.2 SA-cys的合成

配制w（SA）为1.0%的水溶液，按照m（SA）∶m（EDAC）为1.0∶1.2直接加入EDAC粉末，搅拌均匀后，于室温条件下活化45 min［19］；EDAC经室温活化后，按照m（SA）∶m（L-cys）为2.0∶1.0，将称量好的L-cys溶解后缓慢加入其中，并充分搅拌；用0.2 mol/L HCl溶液调节，使体系pH值为4，室温条件下反应2 h后，再用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液调节，使体系pH值为6，继续反应1 h，得到粗产物，其合成流程见图1。将所得粗产物倒入大量乙醇中，过滤，所得沉淀装入已验漏的透析袋中，依次用1 mmol/L HCl溶液、含w（NaCl）为1.0%的1 mmol/L的HCL溶液、含w（NaCl）为0.5%的1 mmol/L HCl溶液分阶段透析，每阶段透析24 h；透析后试样经冷冻干燥得新型保鲜剂——SA-cys，于4 ℃保存备用。

图1 SA-cys的合成流程示意Fig.1 Synthesis route of SA-cys

1.3 测试与表征

紫外-可见光光谱分析：分别将L-cys，SA，SA-cys溶解于超纯水中，控制w（L-cys），w（SA），w（SA-cys）均为0.001%，用超纯水为参比液，波长为200～800 nm。

傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析：分别将L-cys，SA，SA-cys溶解于超纯水中，控制w（L-cys），w（SA），w（SA-cys）均为1.000 %，涂覆于干净的载玻片上，自然晾干后成无色透明膜，以空气为参比进行背景扫描。

巯基含量测定：采用直接碘量法［20］测SA-cys的巯基含量。称取适量SA-cys，配制成质量分数为0.3%的水溶液；用1.0 mol/L HCl溶液调节，使试样pH值为2～3后加入2～5滴质量分数为1.0%的淀粉水溶液；再用1 mmol/L碘溶液滴定，至溶液变为亮蓝色且30 s内不褪色。巯基含量按式（1）计算。

式中：n（—SH）为巯基含量，μmol/g；c（I2）为碘溶液的浓度，mol/L；V（I2）为碘溶液的体积，mL；m（SA-cys）为SA-cys的质量，g。

SA-cys的抑菌效果：采用稀释平板计数法评价SA-cys的抑菌效果。将SA-cys溶于双蒸水，分别配制成质量分数为0.2%，0.5%，1.0%，1.5%的溶液备用。将革兰氏阴性大肠杆菌、革兰氏阳性金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌等菌种划线接种到平板上，于37 ℃恒温培养24 h。分别挑取两个单菌落放入装有9 mL双蒸水的试管中，并按相关方法稀释1 000倍，各取1 mL分别与等体积的质量分数为0.2%，0.5%，1.0%，1.5%的SA-cys溶液混合，摇匀后放置15 min。此时，菌液浓度和SA-cys溶液浓度均减半，吸取0.1 mL不同浓度的混合液涂布到已冷却凝固好的平板培养基上，每次做3个平行实验。空白组实验的菌液不与SA-cys溶液混合，直接涂布到平板上。最后将涂布好的平板于37 ℃恒温培养24 h后记录菌落数。L-cys及SA试样采用上述方法同时进行实验。抑菌率按式（2）计算。

图2 试样的FTIR和紫外-可见光光谱Fig.2 FTIR and UV spectra of samples

2 结果与讨论

2.1 SA-cys的结构

从图2可看出：SA与SA-cys的FTIR谱线具有一定的相似度。SA与SA-cys在3 392 cm-1处宽且强的吸收峰是羟基的伸缩振动峰；1 035，2 931 cm-1处的吸收峰，表示两者分子结构中都含有—CH、CO—C［19］。从图2还可以看出：SA的羧基二聚体在1 415，1 608 cm-1处形成反对称伸缩振动和对称伸缩振动峰，而SA-cys在这两处的吸收峰明显减弱，且在1 249，1 538 cm-1处（分别对应于酰胺Ⅱ带和酰胺Ⅲ带）出现新的吸收峰，表明SA发生相应的衍生化反应，即分子结构中形成了新的酰胺键，对应的吸收峰位于1 630～1 680 cm-1（酰胺Ⅰ），但由于吸收峰相互重叠覆盖，因此表现为此处吸收峰变宽；1 721 cm-1处出现肩峰，可能是因为衍生化反应中生成一定量的酯键和分子结构中有残基（羧基）；另外，2 538 cm-1处新增了1个弱吸收峰，与原料L-cys中的巯基出峰范围和强度均吻合。综上推测，SA分子结构中部分羧基和L-cys上的氨基发生了酰胺化反应，合成了SA-cys。SA-cys在205 nm处的吸收峰对应L-cys中的小肩峰（见图2b），表明实现了L-cys对SA改性的目的，即紫外-可见光光谱与FTIR相互佐证。

2.2 SA-cys的巯基含量

当反应物、反应时间、反应条件和后处理方法相同时，取质量相近的6组试样，用经标定的浓度为0.000 8 mo/L的碘溶液滴定，SA-cys的巯基含量为（295.47±1.85）～（318.46±9.81）μmol/g，与文献［20］报道的结果相近，说明SA-cys的合成方法较为稳定，其巯基含量达到预期水平。

2.3 SA-cys用于鲜切苹果块防褐变实验

配制质量分数为1.000%的SA，SA-cys水溶液，以双蒸水为空白对照，分别处理鲜切苹果块（取自采摘1个月内的苹果），定期观察其对鲜切苹果块的防褐变效果。从图3可以看出：用SA-cys溶液处理的鲜切苹果块，4天内未见明显褐变，而用SA溶液或双蒸水处理的试样褐变明显，其中，用SA溶液处理的效果最差。

2.4 SA-cys，L-cys，SA的抑菌实验

分别以不同浓度的SA-cys，L-cys，SA双蒸水溶液为研究对象，对比考查其对革兰氏阴性大肠杆菌、革兰氏阳性金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌等的抑菌效果［21-22］。

2.4.1 对革兰氏阴性大肠杆菌的抑菌效果

从图4可以看出：L-cys和SA-cys的抑菌率都随浓度增大而上升，最高抑菌率均能达到100.00%；L-cys对革兰氏阴性大肠杆菌的抑菌效果最好，w（L-cys）为0.5%即可达到最佳抑菌效果，而w（SA-cys）为1.0%时达最佳抑菌效果。SA的最高抑菌率只有34.39%，远低于L-cys和SA-cys，且抑菌率随SA浓度增大反而降低。

图4 不同w（SA），w（L-cys），w（SA-cys）对革兰氏阴性大肠杆菌抗菌效果Fig.4 Antibacterial test results of SA，L-cys and SA-cys on Gramnegative Escherichia coli in various concentrations

2.4.2 对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的抑菌效果

从图5可以看出：L-cys对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的抑菌效果很好，在测试浓度范围内均为完全抑菌，w（L-cys）为0.2%即可达到最佳抑菌效果。SA-cys和SA对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的抑菌效果相对较差，SA-cys的最高抑菌率仅为61.26%，与L-cys对比，差异很大，其抑菌效率随浓度减小呈微小下降趋势。SA的抑菌率变化趋势与SA-cys相似，但是在较高浓度（质量分数为1.5%）时，其抑菌率大幅下降，只有9.58%，几乎没有抑菌作用。

图5 不同w（SA），w（L-cys），w（SA-cys）对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌抗菌实验效果Fig.5 Antibacterial test results of SA，L-cys and SA-cys on staphylococcus aureus（gram-positive） in various concentrations

2.4.3 对蜡样芽孢杆菌的抑菌效果

从图6可以看出：L-cys和SA-cys对蜡样芽孢杆菌有相似的抑菌效果，且都明显比SA好。在测试浓度范围内，SA，L-cys，SA-cys均未达到最佳抑菌效果。相对而言，L-cys的抑菌效果较好，其抑菌率随浓度增大而升高，最高抑菌率可达79.63%；SA-cys对蜡样芽胞杆菌的抑菌效果与L-cys相似，最高抑菌率可达77.24%；SA的抑菌效果最差，抑菌率低于40.75%，约为L-cys和SA-cys的一半，且浓度越高，其抑菌率越低。当SA-cys或SA质量分数为0.5%～1.5%时，抑菌率随浓度增大逐渐升高，表明抑菌效果与其浓度存在一定的相关性；当w（L-cys）≥0.5%时，其抑菌率不随浓度增大而产生明显变化。

图6 不同w（SA），w（L-cys），w（SA-cys）对蜡样芽孢杆菌抗菌实验效果Fig.6 Antibacterial test results of SA，L-cys and SA-cys on Bacillus Cereus in various concentrations

3 结论

a）通过化学改性法制备了巯基含量高达328.27 μmol/g的绿色环保型可食用果蔬保鲜剂SA-cys。

b）FTIR分析表明，SA-cys分子结构中含有SA 和L-cys的特征基团。

c）SA-cys具有良好抑菌性，对3种菌株的抑菌效果从大到小为革兰氏阴性大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、革兰氏阳性金黄色葡萄球菌。对革兰氏阴性大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌的最高抑菌率分别为100.00%和77.24%，与L-cys水平相当；对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的作用相对较弱，最高抑菌率只有61.26%。综合分析各试样的抑菌效果，质量分数为0.5%～1.5%的SA-cys水溶液可作为鲜切苹果块保鲜剂。

d）SA-cys综合了SA的成膜性、可生物降解性和L-cys的良好抑菌性等优势，在鲜切水果保鲜领域具有巨大的应用前景。

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Synthesis of green-edible fresh-keeping agent SA-cys for fruit and vegetable

Liu Yi1， Zhang Xulin2， Zheng Chuanjin2， Li Jianle1， Feng Wei1
（1. School of Chemistry and Chemical Engineering， Guangdong Pharmaceutical University， Zhongshan 528458， China；2. School of Food Science， Guangdong Pharmaceutical University， Zhongshan 528458， China）

L-sodium alginate-cysteine（SA-cys）derivative is synthesized by chemical modification based on the film-forming and water retention of sodium alginate（SA）as well as the antibacterial and antioxidant properties of L-cysteine（L-cys），whose sulfhydryl content can reach 328.27 μmol/g. The results of dilution plate counting method show that：within the testing L-cys performs antibacterial effect on Bacillus Cereus，Escherichia coli（Gram-negative），and Staphylococcus aureus（Gram-positive）；the maximum inhibition rate of SA-cys for Escherichia coli（Gram-negative）and Bacillus Cereus are 100.00% and 77.24% respectively， while that of Gram-positive Staphylococcus aureus is only 61.26%；the maximum inhibition rate of SA on three strains are below 40.75%， indicating worst antibacterial effect. Therefore， SA-sys integrates the superiority of L-cys and SA to expand the application range of SA in fresh keeping for fruits and vegetables.

modified sodium alginate； fresh-keeping agent； fresh-cut fruit； antibacterial property

TQ 322.4

B

1002-1396（2016）04-0015-05

2016-01-30；

2016-04-29。

刘意，男，1973年生，博士，副教授，2015年毕业于西北工业大学材料学专业，现主要从事功能高分子合成及其复合材料的应用研究工作。联系电话：（0760）88207939；E-mail：Liuyi@gdpu.edu.cn。

广州市越秀区科技计划项目（2014-WS-029）。