壮骨止痛方对细胞周期蛋白cyclin D1的作用研究

卓海燕，曹卉，杨雪，赵雪君，蒋艳菲，张叔琦，李静，张国民

（湖南中医药大学，湖南长沙410208）

壮骨止痛方对细胞周期蛋白cyclin D1的作用研究

卓海燕，曹卉，杨雪，赵雪君，蒋艳菲，张叔琦，李静，张国民

（湖南中医药大学，湖南长沙410208）

目的：探讨壮骨止痛方抗骨质疏松作用机制。方法：雌性SD大鼠40只随机分为模型组、壮骨止痛方组、阳性对照组、假手术组，给药5 d后制备含药血清。获取新生SD乳鼠成骨细胞，培养至第3代，分别加入4组血清。培养6 d后，测定碱性磷酸酶（ALP）活性，用免疫组化法检测各组细胞中cyclin D1蛋白表达；18 d后进行茜素红染色，观察各组钙化结节。结果：壮骨止痛方组ALP活性以及cyclin D1蛋白表达强于阳性对照组，表明成骨细胞增殖旺盛。结论：壮骨止痛方可提高体外培养成骨细胞cyclin D1表达，对骨质疏松症有治疗效果。

骨质疏松症；壮骨止痛方；细胞周期蛋白D1

壮骨止痛方由补骨脂、淫羊藿、女贞子、川牛膝、枸杞子、狗脊、骨碎补组成，具有补益肝肾、壮骨止痛功效，能有效治疗骨质疏松症［1］，根据原方经过现代技术加工制成的壮骨止痛胶囊也有相同的疗效，但作用机制尚未完全阐明。本次实验通过研究壮骨止痛方对体外成骨细胞的周期蛋白G1期调节蛋白cyclin D1蛋白表达的影响，探讨壮骨止痛方的抗骨质疏松作用，并阐明其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物清洁级10～12个月龄雌性SD大鼠40只，体质量（25±5）g，新生SD乳鼠10只，体质量（45±5）g，由湖南斯莱克景达有限公司提供，许可证号SCXK（湘）2011-0003。

1.1.2 实验药物壮骨止痛胶囊由湖南中医学院附属第一医院药剂科制备（批号980305），胶囊去壳，内容物用凉开水溶解。骨松宝冲剂由贵州富华药业有限责任公司生产（批号97062），10 g/包，3包/d，骨松宝颗粒用冷开水溶解。两种药物均稀释至27%的浓度供大鼠灌胃用。

1.1.3 实验试剂小牛血清、青霉素、链霉素、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒（武汉博士德生物有限公司）；细胞碱性磷酸酶（CAKP）染色试剂盒（南京建成生物工程研究所）；即用型兔抗大鼠cyclin D1多克隆抗体、山羊抗兔抗体、PBS缓冲液、二型胶原酶、0.25%胰蛋白酶、低糖DMEM培养基、酒精、H2O2、二甲苯、枸橼酸钠缓冲溶液、生理盐水、RIPA裂解缓冲液。

1.1.4 实验仪器电热恒温培养箱（长沙实验电炉厂）；电热恒温干燥箱（上海市实验仪器总厂）；电泳仪（北京市六一仪器厂）；离心机、倒置相差显微镜（MOTIC）、酶标仪等。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与造模取清洁级SD雌性大鼠40只，将大鼠按随机数字表法随机分为模型组、壮骨止痛方组、阳性对照组及假手术组4组，其中对模型组、壮骨止痛方组、阳性对照组的大鼠进行去卵巢造模手术，模拟绝经后骨质疏松症。在腹部距离阴道口2～3 cm处，沿腹正中线切开，找到子宫后沿子宫找到卵巢，将卵巢系膜、输卵管系膜连同输卵管结扎后摘除卵巢，确认无出血后将子宫连同脂肪还纳腹腔，进行缝合［2］。假手术组的手术过程与另外3组相同，但不去除卵巢，即在切开腹腔后进行缝合。

1.2.2 制备含药血清模型组、假手术组大鼠灌胃生理盐水，壮骨止痛方组、阳性对照组分别灌胃壮骨止痛方稀释液和骨松宝冲剂稀释液，每天2次，连续5 d。末次给药2 h后股动脉取血，每只取6mL，在4℃下放置4 h，3 000 r/min离心，取血清，于56℃水浴灭活30 min，-20℃保存。同组血清混匀，经0.22μm滤膜抽滤除菌，每管5mL保存，-20℃保存备用。

1.2.3 小鼠原代成骨细胞的培养将新生SD乳鼠10只在75%乙醇溶液中浸泡5min后取出头盖骨，并在PBS缓冲液中处理至骨片透明，尽量剪碎，使体积小于1mm3为佳。将软骨碎片小心移入含有0.25%胰酶的15mL BD管中，然后置于水浴锅中37℃消化30min，每15min振荡1次，加入2mL培养液终止反应，放入离心机中离心1 000 r/min 10min。离心完毕后，去上清液，加入PBS液2mL离心3min，10 00 r/min。去PBS液，再加入二型胶原酶4mL，37℃水浴消化1 h，每30min振荡1次，紧接着1 000 r/min离心10min。去上清液，再加PBS液2mL 1 000 r/min离心3 min。去PBS液，加入培养液并移入25 cm3培养瓶于5% CO237℃条件下继续培养。3～4 d后，观察培养液的污染情况，酌情换液，以后每天观察细胞生长情况和培养液的污染状况，适时换液。一般3～4 d换液1次，细胞生长密集，数量较多，能覆盖大部分培养瓶，即可进行细胞传代。用0.25%的胰酶消化培养瓶中的细胞，将消化下来的部分细胞转移至原瓶培养，将剩下的移至另一培养瓶培养。根据细胞的生长状况，取细胞进行实验，一般取第5代细胞进行实验。

1.2.4 碱性磷酸酶染色和茜素红染色在细胞生长状态良好的情况下取部分细胞进行碱性磷酸酶染色和茜素红染色。在骨细胞培养6 d后测定碱性磷酸酶活性，并进行碱性磷酸酶染色，观察照相。使用pH值为4.2的茜素红Tris-HCl染色液进行染色，观察其钙化结节。

1.2.5 分组添加含药血清分别取成骨细胞经0.25%胰酶消化，接种到24孔培养板中（每组6孔），24 h细胞贴壁后换为含15%血清的培养基（分别加入1.2.2中壮骨止痛方组、模型组、阳性对照组、假手术组含药血清），培养3 d换液1次，运用免疫组化法检测cyclin D1的表达及分布情况，并拍照记录。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 碱性磷酸酶活性检测

与模型组比较，各组ALP活性升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与阳性对照组比较，壮骨止痛方组ALP活性更高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。根据重氮盐法碱性磷酸酶染色显示，胞浆内含有蓝紫色颗粒，说明体外培养的成骨细胞具有合成碱性磷酸酶的活性。结果见表1、图1。

表1 成骨细胞碱性磷酸酶活性测定结果（金氏单位，±s）

表1 成骨细胞碱性磷酸酶活性测定结果（金氏单位，±s）

注：与模型组比较，1）P＜0.05；与阳性对照组比较，2）P＜0.05

组别n ALP模型组10 91.5±7.8阳性对照组10 536.2±26.21）壮骨止痛方组10 589.7±24.21）2）假手术组10 635.4±34.11）

2.2 茜素红染色

茜素红染色均有明显的钙化结节，其中阳性对照组、壮骨止痛方组和假手术组钙化结节多于模型组，且壮骨止痛方组多于阳性对照组，说明壮骨止痛方组成骨细胞分泌ALP的细胞活性强于阳性对照组。结果见图2。

2.3 免疫组化

阳性对照组、假手术组、壮骨止痛方组cyclin D1蛋白表达均强于模型组，壮骨止痛方组cyclin D1蛋白表达强于阳性对照组。结果见表2，图3。

表2 Cyclin D1蛋白表达检测结果比较（±s）

表2 Cyclin D1蛋白表达检测结果比较（±s）

注：与模型组比较，1）P＜0.05

组别含量（%）模型组11.99±1.58阳性对照组17.33±1.501）壮骨止痛方组18.09±1.891）假手术组18.15±1.911）

图1 各组碱性磷酸酶染色（×100）

图2 各组茜素红染色（×400）

图3 各组SABC法DAB显色（×400）

3 讨论

原发性骨质疏松症系老年退行性病变，随着我国人口结构老龄化的进程，其发病率呈逐年上升趋势，因此对其防治药物的开发与研究显得尤为迫切和重要。生理条件下，破骨细胞的骨吸收与成骨细胞的骨形成通过生物耦联机制维持动态平衡，这是维持人体正常骨量的关键。若此平衡被破坏，骨吸收大于骨形成，骨单位大量流失，则会引发骨质疏松［2］。雌激素缺乏时，成骨细胞G1期调节蛋白cyclin D1、CDK4高表达，提示进入增殖周期的成骨细胞增多且增殖加快；而P21高表达，成骨细胞增殖周期G1期进程被阻滞，可能与成骨细胞凋亡增加、数量相对不足有关。成骨细胞G1期调节蛋白通过影响成骨细胞增殖周期在绝经后骨质疏松症发病过程中发挥一定的作用［3］，因此，在细胞水平上研究保障成骨细胞正常功能的药物是防治骨质疏松症的重要方法之一，也是探讨防治骨质疏松症一类药物作用机制的方法。

本实验通过对成骨细胞钙化及增殖分化的相关研究，发现中药壮骨止痛胶囊含药血清加入成骨细胞培养体系后，促使成骨细胞兴奋增殖，同时刺激成骨细胞钙化、增强碱性磷酸酶活性，达到加强成骨细胞增殖、促进成骨细胞分化功能等作用。中医基础理论认为“肾者主蛰，封藏之本，精之处也，其华在发，其充在骨，为阴中之少阴，肾者主水，主骨生髓”，中药壮骨止痛胶囊针对骨质疏松症“肾封藏失职，肾精气亏损”之病机特点组方，确立益阴潜阳之法，振奋阳气，充盈精血，强壮筋骨，有阴阳并补之妙。本实验显示中药壮骨止痛方能在成骨细胞处于G1期时通过增强成骨细胞活性，促进其增殖与分化，从而使人体达到骨充髓满的状态，促进骨的形成。

［1］莫新民，曾英，彭琼辉.壮骨止痛胶囊治疗去卵巢雌鼠骨质疏松症疗效的实验研究［J］.中国中医基础医学杂志，2007，13（3）：195-198.

［2］胡倩倩，靳二辉，任曼，等.动物去卵巢骨质疏松病模型的建立［J］.畜牧与兽医，2015，47（6）：170-171.

［3］.吴银生.成骨细胞G1期调节蛋白与绝经后骨质疏松症关系及中药干预作用的实验研究［D］.福州：福建中医学院，2008.

（编辑：梁葆朱）

The effect of Zhuanggu Zhitong fomula on cyclin D1

Zhuo Haiyan，Cao Hui，Yang Xue，Zhao Xuejun，Jiang Yanfei，Zhang Shuqi，Li Jing，Zhang Guomin
（1.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha Hunan 410208）

Objective：To study themechanism of anti-osteoporosis effect of Zhuanggu Zhitong fomula.Methods：40 female SD ratswere randomly divided intomodel group，positive control group，sam operation group and Zhuanggu Zhitong fomula group.Containing serum was prepared 5 d after administration.Osteoblastsof SD neonatal ratswere obtained and cultured to the third generation，then containing serum ofabovegroupswere respectively added in.6 d after culture，alkaline phosphatase activity and protein expression of cyclin D1 were detected.18 d after culture，calcified nodules were observed through alizarin red staining.Result：Compared with positive control group，ALP activity and protein expression of cyclin D1 of Zhuanggu Zhitong fomula group were increased（P＜0.05）.Conclusion：Zhuanggu Zhitong fomula can improve osteoblast cyclin D1 expression and has therapeutic effecton osteoporosis.

osteoporosis；Zhuanggu Zhitong fomula；cyclin D1

R285

A

1671-0258（2016）06-0005-03

2014年湖南省教育厅科学研究优秀青年项目（14B130）；2015年度湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目（2015217，2015220）；2016年度湖南省中医药科研计划重点项目（201612）；2015年地方高校国家级大学生创新创业训练计划（201510541013）

卓海燕，讲师，E-mail：280733293@qq.com

张国民，博士，教授，E-mail：834095773@qq.com