纳米SiO2亲和吸附剂的制备及性能

邹雪艳，张于涛，王　朋，董　烁，郭静玉，何建英*

(1.河南大学 纳米材料工程研究中心，河南 开封 475004；　2.河南大学 民生学院，河南 开封 475004；3.河南大学 医学院,河南 开封 475004；　4. 河南大学 化学化工学院,河南 开封 475004)



纳米SiO2亲和吸附剂的制备及性能

邹雪艳1，张于涛2，王朋2，董烁3，郭静玉4，何建英4*

(1.河南大学 纳米材料工程研究中心，河南 开封 475004；2.河南大学 民生学院，河南 开封 475004；3.河南大学 医学院,河南 开封 475004；4. 河南大学 化学化工学院,河南 开封 475004)

采用水热法一步合成了巯基纳米二氧化硅(SiO2-SH)，随后在其表面修饰亚氨基二乙酸基团(-IDA)得到了SiO2-SH/IDA，利用-SH和-IDA双官能团更多的吸附溶液中的Ni2+，从而得到SiO2-SH/IDA-Ni2+纳米亲和吸附剂. 制备的亲和吸附剂可直接用于六聚组氨酸为标签的(His-tagged)融合蛋白的分离纯化. 利用TEM、FT-IR、TG、SDS-PAGE等大型仪器表征了样品的形貌、结构及亲和分离能力. 结果表明制备的SiO2-SH/IDA-Ni2+纳米亲和吸附剂平均粒径为60 nm，对His-tagged蛋白具有较好的特异性和较低的检测限(约为1.9×10-5mol/L)，且该吸附剂再生能力较强，再生3次后对目标蛋白仍具有较好的分离效果.

纳米二氧化硅；功能化；His-tagged；亲和分离

蛋白质作为生物体内的基础物质，于生物体具有极为重要的作用. 为了进一步研究特定蛋白的物理化学性能，首要的就是对该目标蛋白进行分离纯化[1]. 目前蛋白质分离提纯的常规方法有：色谱法、毛细管电泳法、反胶团萃取法、盐析法、层析法、累加进样分离法、超滤技术等[2-5]. 其中亲和层析分离技术是一种成本低廉、选择性好、分离效率高的蛋白质分离手段[6-8]. 它的主要原理是亲和吸附剂的配体分子与目标蛋白进行特异性结合，从而达到分离提纯目标蛋白的目的. 尽管如此，它也存在放大困难、操作繁琐、层析柱易被污染和堵塞等缺点. 近年来将无机微/纳米材料用作亲和沉淀的载体是近年来的研究热点[9-10]. BAE等[11]在SiO2纳米管表面修饰了Au纳米颗粒，再以Au颗粒为桥梁，实现对半胱氨酸(Cys)及含有Cys片段的其它蛋白的分离纯化. XU等[12]在磁性Fe2O3表面偶联多巴胺分子，用于对His-tagged融合蛋白的分离纯化，该磁性纳米颗粒具有高度的专一性，并可回收再利用. 由于这些亲和吸附剂通常只含有只有一种螯合基团，吸附Ni2+能力相对较弱，本文中我们采用生物相容性好的纳米二氧化硅为载体[13-15]，以-SH和-IDA双功能化螯合基团为有效基团，可以更多的吸附溶液中的Ni2+，从而更好的分离纯化His-tagged融合蛋白.

1　实验部分

1.1试剂与仪器

巯基丙基三甲氧基硅烷(MPS，95%)购于Alfa-Aesar公司；十六烷基三甲基氯化铵(CTAC，≥98.0%)购于国药集团化学试剂有限公司；亚氨基二乙酸(IDA，≥98%)和三乙醇胺(TEA，≥99.0%)，γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS，≥97%)均购于阿拉丁公司；氯化镍(NiCl2·6H2O，98%)，无水乙醇(C2H5OH，≥99.7%)和氢氧化钠(NaOH，≥96%)均购于天津市科密欧化学试剂有限公司；正硅酸乙酯(TEOS，99%)购于天津市福晨化学试剂厂；浓盐酸(HCl，37%)购于洛阳昊华化学试剂厂.

样品的形貌组成分别使用透射电子显微镜(TEM，日本电子株式会社)、热重分析仪(TG，Merrler-Toledo Instruments公司)、傅立叶变换红外光谱仪(FT-IR，美国尼高力公司)及原子吸收分光光度计(AAS，日本日立公司)进行检测. 捕获的His-tagged蛋白用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(SDS-PAGE，Power PAC 300，郑州宝赛科贸有限公司)，稳压电压是70 V，分离电压是120 V.

1.2实验过程

1.2.1合成SiO2-SH样品

取17 mL CTAC于50 mL三口瓶内，加入2.8 mL无水乙醇，室温搅拌10 min；加入1.1 mL TEA，继续搅拌20 min升温至60 ℃，缓慢滴加1.5 mL TEOS和MPS混合液(体积比1∶10)，持续反应3 h后转入50 mL高压反应釜中，110 ℃反应48 h，冷至室温后离心洗涤干燥，即得SiO2-SH样品.

1.2.2合成SiO2-SH/IDA样品

取20 mL IDA溶液于三口瓶中，用2 mol/L NaOH溶液调溶液pH至11，冰浴条件下滴加2 mL GPTMS，搅匀后升温至65 ℃反应12 h. 取3 mL上述产物用6 mol/L HCl调溶液pH至2，加入0.1 g SiO2-SH样品，搅匀后升温至90 ℃继续反应3 h. 反应结束后得到的沉淀充分洗涤后即得SiO2-SH/IDA样品，60 ℃烘干后备用.

1.2.3合成SiO2-SH/IDA-Ni2+样品

取50 mL 2 mol/L NiCl2溶液于试管中，加入3 mg SiO2-SH/IDA样品，分散均匀后25℃振荡反应2 h，沉淀充分洗涤后即得SiO2-SH/IDA-Ni2+样品，样品分散在1 mL 25%的乙醇中备用.

1.2.4His-tagged 蛋白的分离方案

将SiO2-SH/IDA-Ni2+样品用破菌buffer(20 mmolL-1Tris-HCl，含0.2 mol·L-1NaCl)洗涤数次后沉淀中直接加入1 000 μL细胞裂解液，于4 ℃摇床上孵育2 h；孵育后的样品用上述破菌 buffer洗涤数次以除去表面物理吸附的蛋白. 随后加入300 μL一定浓度的咪唑进行洗脱，洗脱后的蛋白用于SDS-PAGE分析. 将洗脱后的亲和吸附剂用EDTA和NiCl2溶液处理后，重复以上步骤3次，以检测其再生后分离目标蛋白的能力.

2　结果与讨论

2.1TEM表征分析

图1为SiO2-SH/IDA样品的透射图及粒径分布图. 从图1a、1b可以看出，制备的样品为实心微球，平均粒径为108 nm，分散性好(图1c).

2.2FT-IR表征分析

图2为合成的SiO2-SH(1)和SiO2-SH/IDA(2)样品的FT-IR图. 从图中可以看出，3 428 cm-1为样品表面吸附水的-OH的吸收峰；1 124 cm-1、804 cm-1、694 cm-1处对应SiO2的特征吸收峰：1 124 cm-1归属于Si-O-Si的反对称伸缩吸收峰，804 cm-1为Si-O对称伸缩振动吸收峰；在2 550 cm-1处为-SH的伸缩振动，说明制备的样品表面含有-SH. 从图2曲线2可以看出，2 930 cm-1为-IDA与GPTMS上的亚甲基的伸缩振动峰，694 cm-1为IDA中-NH键的伸缩振动峰，说明-IDA与-SH均修饰在了SiO2的表面[16-17].

图1　制备SiO2-SH/IDA样品的TEM图(a,b)和粒径分布图(c)Fig.1　TEM images (a,b) and size distribution histogram (c) of the prepared SiO2-SH/IDA

图2　制备SiO2-SH (1)和SiO2-SH/IDA (2)样品的FT-IR图Fig.2　FT-IR spectra of the prepared SiO2-SH (1) and SiO2-SH/IDA (2) samples

2.3TG曲线分析

图3为制备SiO2-SH(1)和SiO2-SH/IDA(2)的TG图，从图3中可以看出样品从室温～800 ℃有明显的失重，其中主要的失重出现在220～700 ℃，从曲线1可以看出样品SiO2-SH的失重率约为52.3%，这主要为表面巯基的热分解. 从曲线2可以看出，样品SiO2-SH/IDA的失重率为57.4%，这主要是由于表面修饰的-SH和-IDA基团的热分解所致，说明二氧化硅载体表面具有较高的官能团密度.

图3　制备SiO2-SH(1)和SiO2-SH/IDA (2)样品的TG曲线Fig.3　TG curves of the prepared SiO2-SH (1) and SiO2-SH/IDA (2) samples

2.4分离蛋白示意图

图4为SiO2-SH/IDA-Ni2+样品的制备以及分离His-tagged TRX融合蛋白的示意图. 首先，采用TEOS与MPS共同水解合成了SiO2-SH纳米微球. 随后在SiO2-SH微球表面修饰-IDA基团形成SiO2-SH/IDA复合微球，然后继续吸附Ni2+形成SiO2-SH/IDA-Ni2+亲和吸附剂. 最后用制备的SiO2-SH/IDA-Ni2+纳米吸附剂直接应用于His-tagged TRX融合蛋白的分离纯化. 文中采用-SH和-IDA长短相间的两种连接臂，一定程度上减小了分离蛋白时的空间位阻，从而可以更好地实现对目标蛋白的亲和分离.

图4　SiO2-SH/IDA-Ni2+样品的制备及其分离His-tagged TRX融合蛋白示意图Fig.4　Synthesis of the SiO2-SH/IDA-Ni2+ sample and separation of His-tagged TRX protein by the prepared sample

2.5SDS-PAGE分析

图5为SiO2-SH/IDA-Ni2+亲和吸附剂在不同咪唑浓度(0.5～3 mol/L)洗脱条件下分离His-tagged蛋白的SDS-PAGE图. 泳道1～2为Marker与混合蛋白，泳道3～6咪唑浓度分别为0.5、1、2及3 mol/L. 从图5中可以看出，随着咪唑洗脱浓度的增加，洗脱目标蛋白的量略有变化，当咪唑浓度为1 mol/L时，洗脱下来目标蛋白已达到最大，且几乎没有杂蛋白. 因此，咪唑的最佳洗脱浓度为1 mol/L.

图5　不同浓度咪唑洗脱条件下SiO2-SH/IDA-Ni2+亲和吸附剂分离His-tagged TRX融合蛋白的SDS-PAGE图Fig.5　SDS-PAGE analysis of purified His-tagged TRX proteins by the prepared SiO2-SH/IDA-Ni2+ adsorbent

为测试制备SiO2-SH/IDA-Ni2+亲和吸附剂对目标蛋白的检测限，我们对不同浓度梯度的His-tagged TRX蛋白进行检测. 图6中泳道1～4为不同His-tagged TRX浓度加入量分离蛋白的SDS-PAGE图：泳道1，1.9×10-4mol/L；泳道2，1.9×10-5mol/L；泳道3，1.9×10-6mol/L；泳道4，1.9×10-7mol/L. 从泳道1～4可以看出，当His-tagged TRX浓度在1.9×10-4～1.9×10-5mol/L时，制备的吸附剂对目标蛋白均有较好的检测效果，而当蛋白浓度低于1.9×10-6mol/L时，该吸附剂不能检测到目标蛋白，说明制备的SiO2-SH/IDA-Ni2+吸附剂对His-tagged TRX蛋白的检测限至少为1.9×10-5mol/L，具有较好的响应效果.

图6　不同梯度的His-tagged TRX蛋白下SiO2-SH/IDA-Ni2+亲和吸附剂分离His-tagged TRX蛋白的电泳图Fig.6　SDS-PAGE of His-tagged TRX protein separated by prepared SiO2-SH/IDA-Ni2+ adsorbent in different concen-tration of His-tagged TRX proteins

为了验证制备SiO2-SH/IDA-Ni2+吸附剂再生后分离His-tagged TRX蛋白的能力，我们采用EDTA和NiCl2溶液对亲和吸附剂进行预处理. 图7为SiO2-SH/IDA-Ni2+吸附剂分离His-tagged TRX蛋白的SDS-PAGE图. 其中，泳道1为Marker，泳道2为混合蛋白，泳道3、4、5分别为第一、二、三次再生后亲和吸附剂对His-tagged TRX蛋白分离的电泳图. 从图7可以看出，再生三次后的微球，仍然对混合蛋白中的His-tagged TRX蛋白有比较高的分离能力，说明制备的SiO2-SH/IDA-Ni2+吸附剂具有较强的再生能力.

图7　SiO2-SH/IDA-Ni2+吸附剂再生后分离His-tagged TRX蛋白的SDS-PAGE图Fig.7　SDS-PAGE analysis of purified His-tagged TRX proteins by the prepared SiO2-SH/IDA-Ni2+ adsorbent for three times

3　结论

利用水热反应合成了巯基纳米二氧化硅(SiO2-SH). 然后在其表面修饰亚氨基二乙酸基团(-IDA)，形成了SiO2-SH/IDA双功能团纳米微球，吸附Ni2+后用于His-tagged融合蛋白的特异性分离，该纳米吸附剂对目标蛋白具有较低的检测限及较强的再生能力，具有潜在的市场价值.

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[责任编辑：刘红玲]

Preparation and properties of nano-SiO2affinity adsorbent

ZOU Xueyan1, ZHANG Yutao2, WANG Peng2, DONG Shuo3, GUO Jingyu4, HE Jianying4*

(1.EngineeringResearchCenterforNanomaterials,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China; 2.HenanUniversityMinshengCollege,Kaifeng475004,Henan,China; 3.HenanUniversitySchoolofMedicine,Kaifeng475004,Henan,China; 4.Collegeofchemistryandchemicalengineering,HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China)

Silica nanospheres (NSs) with thiol group (SiO2-SH) were synthesized by the hydrothermal method. Then the iminodiacetic acid group (-IDA) was modified on the surface of SiO2-SH to obtain SiO2-SH/IDA NSs. Subsequently the Ni2+ions in the solution were adsorbed by both -SH group and -IDA group of SiO2-SH/IDA NSs, which could adsorb more Ni2+on the surface of these NSs to get SiO2-SH/IDA-Ni2+adsorbent. Then the adsorbent was used to separate His-tagged proteins. The morphology, composition and affinity separation properties were detected by TEM, FT-IR, TG and SDS-PAGE. The results show that the average size of the prepared SiO2-SH/IDA-Ni2+adsorbent is about 60 nm, which can separate the His-tagged protein specificly and has lower detection limit (1.9×10-5mol/L) and the better regeneration ability after three times reuse.

nanometer silica; functionalization; His-tagged; affinity separation

1008-1011(2016)04-0482-05

2015-05-15.

国家自然科学基金(21271062), 河南大学民生学院大学生创新创业训练计划项目(MSCXCY2015004).

邹雪艳(1981-), 女, 实验师, 研究方向为复合纳米材料的制备及其对蛋白质的亲和分离.*通讯联系人, E-mail:hjy@henu.edu.cn.

O61

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