CLSI M38-A2及M27-A3方案分析足癣36株真菌的药敏特征

卜晓琳　范娟　胡晓莉　蒋建华　瞿子伟　顾军

(1.上海市浦东新区公利医院皮肤科，上海 200135；2.第二军医大学长海医院皮肤科，上海 200433)



CLSI M38-A2及M27-A3方案分析足癣36株真菌的药敏特征

卜晓琳1范娟1胡晓莉1蒋建华1瞿子伟1顾军2

(1.上海市浦东新区公利医院皮肤科，上海 200135；2.第二军医大学长海医院皮肤科，上海 200433)

目的探讨氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑、特比萘芬、两性霉素B、咪康唑、5-氟胞嘧啶对36株足癣致病菌的体外抑菌特征。方法对55例临床疑似足癣患者行真菌镜检、培养和鉴定。分别应用美国临床实验室标准化委员会 (Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M38-A2和M27-A3方案针对其中的皮肤癣菌和念珠菌，检测8种药物对不同真菌的最低抑菌浓度 (Minimum inhibitory concentration，MIC)。结果镜检及培养均为阳性的真菌36株，计8个菌种：红色毛癣菌、须癣毛癣菌、石膏样小孢子菌、絮状毛癣菌、羊毛状小孢子菌、白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌；属2大类：皮肤癣菌、念珠菌。8种药物对8种真菌的MIC值比较，抑菌效果存在显著差异 (P<0.05)。皮肤癣菌和念珠菌2大类比较，除伊曲康唑外 (P>0.05)，其余7种药物的抑菌效果存在显著差异 (P<0.05)。其中，特比萘芬对皮肤癣菌的平均秩次最小。5-氟胞嘧啶对念珠菌的平均秩次最小。结论上述8种药物的体外药敏实验提示，8种药物对8种真菌的抑菌效果存在显著差异。除伊曲康唑外，其余7种药物对皮肤癣菌和念珠菌的抑菌效果存在显著差异。相对而言，特比萘芬对皮肤癣菌抑菌效果更好，5-氟胞嘧啶对念珠菌抑菌效果更好。

足癣；皮肤癣菌；念珠菌；药敏实验；M38-A2；M27-A3

[Chin J Mycol，2016，11(3):169-173]

目前治疗足癣的常见外用抗真菌药主要包括唑类、多烯类和丙烯胺类，各类药物的抗菌谱不同。根据菌株的药敏实验选择用药最具实用性。本课题运用全新的美国临床实验室标准化委员会 (Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M38-A2与M27-A3方案，分别对足癣的皮肤癣菌和念珠菌进行抗真菌药物敏感性测定，为临床用药提供参考。

1　材料和方法

1.1主要试剂及仪器

沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂培养基 (SDA培养基) (含50 mg/L氯霉素)，马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA培养基)、YEPD培养液、RPMI-1640培养液 (Thermo公司)、全温振荡培养箱 (HZQ-F160型，苏州培英实验设备有限公司)；单人双面净化工作台 (SW-CT-IF型，苏州净化有限公司)；生物显微镜 (B203LED型，重庆奥特光学仪器有限公司)；酶标检测仪 (Multiskan MK3型，芬兰Labsystems)；智能霉菌培养箱 (MJX型，宁波江南仪器厂)；酶标板振荡器 (IKA MTS型，德国IKA集团)；96孔培养板 (丹麦Nunclon公司)。

1.2实验菌株

依据《中国临床皮肤病学》足癣的临床表现[1]，收集2014年6～12月在本科室就诊的临床疑似足癣患者55例。标本采用10%KOH直接涂片镜检有无菌丝或孢子，将镜检阳性的菌株接种在SDA培养基上，置于28℃恒温箱，常规培养。每天观察菌落的生长情况、颜色、形态特点，必要时用玻片小培养以鉴定到种[2]。4周后将其中的皮肤癣菌接种至PDA上，28℃恒温箱，常规培养10～14 d。念珠菌接种至SDA培养基，28～35℃恒温箱，培养2～3 d。用于菌悬液制备。质控菌株选用CLSI推荐的近平滑念珠菌ATCC22019。

1.3抗真菌药物

氟康唑 (FCZ)(辉瑞制药有限公司)、伊曲康唑 (ITR)(Sigma公司)、伏立康唑 (VCZ)(Sigma公司)、酮康唑 (KETO)(Sigma公司)、特比萘芬 (TER)(齐鲁公司)，两性霉素B (AmB)(Sigma公司)，咪康唑 (MIC)(Sigma公司)、5-氟胞嘧啶 (5-FC)(中国药科大学制药公司)。各药物工作浓度范围为：氟康唑0.125～64 μg/mL，其余药物均为0.031 2～16 μg/mL。脂溶性药物溶于二甲亚砜 (DMSO)，且二甲亚砜浓度不超过1%。

1.4真菌菌悬液制备

皮肤癣菌取出PDA培养板上的皮肤癣菌，1%吐温20洗菌，接种钩刮取少量菌落，放入白色陶瓷研钵充分研磨，细纱布过滤。RPMI-1640培养液稀释，血细胞计数板计数，调整菌液浓度至1×104～3×105CFU/mL，接种菌悬液。

念珠菌从SDA培养板上挑取少量念珠菌，接种至含1 mL YEPD培养液的玻璃管内，30℃，200 r/min恒温振荡培养24 h。取10 μL菌液接种至含1 mL YEPD培养液的玻璃管内，同样的条件下再次活化16 h，使真菌处于指数生长期的后期。RPMI-1640培养液稀释，血细胞计数板计数，调整菌液浓度至 (1～5)×103CFU/mL，接种菌悬液。

1.5药敏反应板的制备

取无菌96孔板，每排1号孔加RPMI-1640 100 μL作空白对照；3～12号孔各加新鲜配制的菌液100 μL；2号孔分别加菌液198 μL和受试药物溶液2 μL；12号孔不含药物，只加菌液100 μL作阳性生长对照。2～11号孔进行倍比稀释，使氟康唑各孔的最终药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/mL，其余抗真菌药物各孔的最终药物浓度均分别为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5和0.031 2 μg/mL，配制过程中每一浓度梯度完成后应更换枪头。每次配制药敏板的同时均制备一质控菌药敏板，各药敏板于35℃恒温保湿培养箱中静止孵育48 h，其最小抑菌浓度 (Minimum inhibitory concentration，MIC)参考值如下：氟康唑的MIC值2.0～8.0 μg/mL，只有当其MIC值界于上述范围时，方认为试验操作准确可靠。如同时试验菌株生长良好，则可认为试验成功，结果可接受。

1.6最小抑菌浓度的判定

根据M38-A2方案的判读标准,将与生长对照孔比较≥80%生长抑制的最小药物浓度作为药物的MIC值。M27-A3方案以生长对照孔比较≥50%生长抑制的最小药物浓度作为药物的MIC值。两性霉素B以生长对照孔比较100%生长抑制的最小药物浓度作为药物的MIC值。采用肉眼判读与酶标分析仪相结合的方式进行判定。肉眼判读由2人在自然光线下进行，M38-A2方案为与对照孔相比超过80%生长抑制的最低药物浓度 (即生长显著减少达80%)，M27-A3方案为超过50%生长抑制的最低药物浓度 (即生长减少一半)，两性霉素B为超过100%生长抑制的最低药物浓度 (即看不到菌生长)。用酶标分析仪于630 nm测各孔OD值。阳性对照孔的OD值控制在0.2左右，与阳性对照孔比较，M38-A2方案以OD值下降80%以上的最小浓度孔中的药物浓度为MIC值，M27-A3方案以OD值下降50%以上的最小浓度孔中的药物浓度为MIC值，两性霉素B以OD值下降100%的最小浓度孔中的药物浓度为MIC值。肉眼和酶标测度双重测定相结合，避免结果误差。当药物的MIC值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：MIC值高于最高浓度64 μg/mL时，计为“>64 μg/mL”；药物MIC值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为“≤0.031 2 μg/mL”。上述实验均平行操作2～3次，当MIC值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以最低浓度作为MIC值；当MIC值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。

1.7统计学处理

采用SPSS 17.0进行数据分析，不同抗真菌药物间MIC值进行Kruskal-Wallis秩和检验，两独立菌种样本之间比较采用Wilcoxon秩和检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

2　结　　果

选取的足癣疑似患者总计55例，真菌镜检及培养均为阳性的菌株36株 (65.45%)，鉴定后发现属8种、2大类。其中皮肤癣菌29例 (80.56%)：红色毛癣菌18例 (50.00%)，须癣毛癣菌4例 (11.11%)，石膏样小孢子菌3例 (8.33%)，絮状毛癣菌及羊毛状小孢子菌各2例 (5.56%)；念珠菌7例 (19.44%)：白念珠菌3例 (8.33%)，光滑念珠菌2例 (5.56%)，克柔念珠菌2例 (5.56%)。

8种抗真菌药物对36株受试菌的MIC值范围见表1。MIC最低值为0.031 2 μg/mL，出现在伏立康唑作用6种真菌，红色毛癣菌、须癣毛癣菌、絮状毛癣菌、白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌。特比萘芬作用5种真菌，红色毛癣菌、须癣毛癣菌、石膏样小孢子菌、絮状毛癣菌、羊毛状小孢子菌。酮康唑作用4种真菌，絮状毛癣菌、白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌。MIC值最高值为>64 μg/mL，出现在氟康唑对羊毛状小孢子菌。

表1　8种抗真菌药物对8种真菌的MIC范围 (μg/mL)

8种药物对8种真菌的MIC平均秩次的比较见表2。8种抗真菌药物对8种真菌的MIC值均存在显著差异，差异有统计学意义 (P<0.05)。平均秩次比较后发现，伊曲康唑对羊毛状小孢子菌的抑菌效果较强，对石膏样小孢子菌的抑菌效果较弱。特比萘芬对羊毛状小孢子菌的抑菌效果较强，对白念珠菌的抑菌效果较弱。酮康唑对羊毛状小孢子菌的抑菌效果较强，对石膏样小孢子菌的抑菌效果较弱。伏立康唑对羊毛状小孢子菌的抑菌效果较强，对石膏样小孢子菌的抑菌效果较弱。咪康唑对羊毛状小孢子菌的抑菌效果较强，对石膏样小孢子菌的抑菌效果较弱。5-氟胞嘧啶对光滑念珠菌的抑菌效果较强，对红色毛癣菌、须癣毛癣菌、石膏样小孢子菌、絮状毛癣菌、羊毛状小孢子菌均的抑菌效果较弱。两性霉素B对光滑念珠菌的抑菌效果较强，对石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌的抑菌效果较弱。氟康唑对光滑念珠菌的抑菌效果较强，对石膏样小孢子菌的抑菌效果较弱。

8种抗真菌药物在皮肤癣菌和念珠菌两大类菌种间的MIC平均秩次的比较见表3。除伊曲康唑之外，其余7种抗真菌药物对两大类真菌的MIC均存在显著差异，差异有统计学意义 (P<0.05)。特比萘芬对皮肤癣菌的平均秩次最小。5-氟胞嘧啶对念珠菌的平均秩次最小。

表2　每种抗真菌药物对8种真菌的MIC平均秩次的比较结果

注：表中多个独立样本的比较采用Kruskal-Wallis法

表3　每种抗真菌药物在皮肤癣菌和念珠菌间的MIC平均秩次的比较结果

注：表中两个独立样本的比较采用Wilcoxon法

3　讨　　论

足癣是致病性皮肤癣菌在足部引起的皮肤病，该病多发。足癣治疗最好根据体外药敏结果指导临床用药，在最安全、经济的情况下获得最佳疗效。有研究显示，CLSI M38-A2方案操作简便，具有良好的重复性和稳定性[3]。胡小平等[4]运用该方案对须癣毛癣菌进行抗真菌药物敏感性试验，发现不同抗真菌药物对须癣毛癣菌的药敏存在明显差异。Luciana等[5]利用M38-A2方案，研究原儿茶酸协同氟康唑对红色毛癣菌和须癣毛癣菌的抑菌作用，发现氟康唑联合原儿茶酸后，抑菌作用明显增强。聂振华等[6]利用M27-A方案发现酮康唑和萘替芬、特比萘芬联合应用对浅部真菌病的致病菌具有协同抑菌作用。

本实验首先鉴定了足癣的致病菌种，发现培养阳性的36株真菌，属8个种：红色毛癣菌、须癣毛癣菌、石膏样小孢子菌、絮状毛癣菌、羊毛状小孢子菌、白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌；两大类：皮肤癣菌、念珠菌。目前的抗真菌药物发展相对缓慢，我们尽量全面的选取了8种抗真菌药物：氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑、特比萘芬，两性霉素B，咪康唑、5-氟胞嘧啶。运用CLSI M38-A2方案检测皮肤癣菌 (红色毛癣菌、须癣毛癣菌、石膏样小孢子菌、絮状毛癣菌、羊毛状小孢子菌)的药物敏感性实验，运用M27-A3方案检测念珠菌 (白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌)[7-8]。

从浓度范围看，MIC最低值为0.031 2 μg/mL，伏立康唑次数最多，为6次，针对的菌种既包括皮肤癣菌也包括念珠菌。特比萘芬5次，针对的全部为皮肤癣菌。酮康唑4次，以念珠菌为主。MIC最高值为>64 μg/mL，出现在氟康唑对羊毛状小孢子菌，这一现象虽与氟康唑的配置浓度有一定关系，但也提示氟康唑的药敏度不高。

8种药物对8种真菌的MIC值比较后发现，8种药物对8种真菌的药敏存在显著差异。同时还发现5-氟胞嘧啶对皮肤癣菌的抑菌效果均较弱，但对念珠菌的抑菌效果均较强。特比萘芬对皮肤癣菌的抑菌效果均较强，对念珠菌的抑菌效果均较弱。将实验菌种分为皮肤癣菌和念珠菌两大类进行比较，若平均秩次越小，则药物对该类真菌的抑菌效果越强。结果，除伊曲康唑外，其余7种抗真菌药物对两大类真菌的MIC值均存在显著差异。其中，特比萘芬对表皮癣菌的平均秩次值最小，对念珠菌的平均秩次值最大，提示其对表皮癣菌的抑菌效果较强，对念珠菌的抑菌效果较弱。相反的，5-氟胞嘧啶对念珠菌的平均秩次值最小，对表皮癣菌的平均秩次值最大，提示其对念珠菌的抑菌效果较强，对皮肤癣菌的抑菌效果较弱。

本实验提示，以氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑、特比萘芬，两性霉素B，咪康唑、5-氟胞嘧啶在内的8种抗真菌药物，对取自足癣的8种真菌的药敏存在显著差异。对于菌种鉴定为皮肤癣菌者，特比萘芬的体外抑菌效果似乎更好[9]；对于念珠菌感染者，5-氟胞嘧啶的抑菌效果似乎更佳。由于样本量有限，本课题的结果仅为足癣的临床用药提供一定参考。同时，由于5-氟胞嘧啶尚无外用剂型，本次体外试验结果尚有待体内试验进一步证实。

[1]赵辨.中国临床皮肤病学[M].第1版.南京：江苏科学技术出版社.2009：555-556.

[2]胡晓莉，郑舜华，田丹，等.上海浦东新区浅表真菌病及其致病菌种的分布特征分析[J].中国真菌学杂志，2007，2 (6)：342-345.

[3]Gupta P,Khare V,Kumar D，et al.Comparative evaluation of disc diffusion and E-test with broth micro-dilution in susceptibility testing of amphotericin B，voriconazole and caspofungin against clinicalAspergillusisolates[J].J Clin Diagn Res，2015，9(1)：DC04-DC07.

[4]胡小平，王喆，李若瑜.应用CLSI M38-A2方案测定须癣毛癣菌对抗真菌药物敏感性[J].中国真菌学杂志，2011，6(3)：149-153.

[5]Soares LA,Gullo FP,Sardi Jde C，et al.Anti-trichophyton activity of protocatechuates and their synergism with fluconazole[J].Evid Based Complement Alternat Med，2014，2014：957860.

[6]聂振华，孔祥君，李振化.224株临床分离浅部真菌病致病病原菌药物敏感实验分析[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2011，10(3)：171-173.

[7]Espinel-Ingroff A,Chowdhary A,Gonzalez GM，et al.Multicenter study of isavuconazole MIC distributions and epidemiological cutoff values forAspergillusspp.for the CLSI M38-A2 broth microdilution method[J].Antimicrob Agents Chemother，2013，57(8):3823-3828.

[8]Alexander BD,Byrne TC,Smith KL，et al.Comparative evaluation of Etest and sensititre yeastone panels against the Clinical and Laboratory Standards Institute M27-A2 reference broth microdilution method for testingCandidasusceptibility to seven antifungal agents[J].J Clin Microbiol，2007，45(3)：698-706.

[9]Evans EG,Dodman B,Williamson DM，et al.Comparison of terbinafine and clotrimazole in treating tinea pedis[J].BMJ，1993，307(6905)：645-647.

[本文编辑]王飞

Antifungal susceptibilities of 36 isolates from tinea pedis evaluated with CLSI M38-A2 and M27-A3 schemes

BU Xiao-lin1,FAN Juan1,HU Xiao-li1,JIANG Jian-hua1,QU Zi-wei1,GU Jun2

(1.Desect1mentofDermatology,Gonglihospital,Shanghai200135;2.Desect1mentofDermatology,Changhaihospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433)

ObjectiveTo investigate the antifungal characteristics of fluconazole (FCZ),itraconazole (ITR),voriconazole (VCZ),ketoconazole (KETO),terbinafine (TER),amphotericin B (AmB),miconazole (MIC),5-fluorocytosine (5-FC) to thirty six isolates from tinea pedis.MethodsA total of fifty five fungal samples from suspected patients with tinea pedis were examined by microscopy,culture and identification.Minimum inhibitory concentrations (MICs)were determined by Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)M38-A2 and M27-A3 scheme.ResultsThirty six strains of pathogenic fungi were isolated,which were positive both in microscopic examination and culture.They were identified as eight species:Trichophytonrubrum,Trichophytonmentagrophytes,Microsporumflavescens,Trichophytonfloccosum,Microsporonlanosum,Candidaalbicans，Candidaglabrata，Candidakrusei,and two categories:DermatophyteandCandida.DermatophyteandCandidawere evaluated with CLSI M38-A2 scheme and M27-A3,respectively.The MICs of eight kinds of antifungal agents to eight kinds of fungi were compared.There were significant differences in MICs of eight kinds of fungi using FCZ,ITR,VCZ,KETO,TER,AMB,MIC and 5-FC (P<0.05).ComparisonoftheMICsofDermatophyteandCandida,thereweresignificantdifferencesusingFCZ,VCZ,KETO,TER,AMB,MIC,5-FC(P<0.05),except for ITR (P>0.05).The mean rank of TER againstDermatophytewas minimum.ConclusionEight antifungal agents had significant different antifungal characteristics against eight kinds of fungi.Except ITR,others had significant differences of antifungal characteristics betweenDermatophyteandCandida.Comparatively,TER showed the best effect againstDermatophyte.

tinea pedis；Dermatophyte；Candida；antifungal susceptibility；M38-A2 scheme；M27-A3 scheme

2016-04-08

浦东新区卫生系统优秀青年医学人才培养计划 (PWRq2013-02)，上海市科委生物医药领域产学研合作项目 (13DZ1930906)

卜晓琳，女 (蒙古族)，博士，主治医师.E-mail:xiaolinbu@yeah.net

顾军，E-mail:gujun79@163.com

R 978.5

A

1673-3827(2016)11-0169-05