铅和邻苯二甲酸二丁酯联合暴露对斑马鱼胚胎的影响
2016-08-15刘红阳茆广华冯伟伟丁阳阳仰榴青吴向阳
刘红阳, 茆广华, 许 海, 冯伟伟, 赵 婷, 丁阳阳, 陈 瑶, 仰榴青,吴向阳*
1.江苏大学环境安全与工程学院, 江苏 镇江 212013;2.江苏大学化学化工学院, 江苏 镇江 212013
铅和邻苯二甲酸二丁酯联合暴露对斑马鱼胚胎的影响
刘红阳1,茆广华1,许海1,冯伟伟1,赵婷2,丁阳阳2,陈瑶1,仰榴青2,吴向阳1*
1.江苏大学环境安全与工程学院, 江苏 镇江 212013;2.江苏大学化学化工学院, 江苏 镇江 212013
为了研究铅(Pb)和邻苯二甲酸二丁酯(DBP)单独及联合暴露对斑马鱼胚胎神经发育和细胞凋亡相关基因表达的影响,考察两者对斑马鱼胚胎神经系统的毒性作用。将720个斑马鱼胚胎按3×3析因设计随机分为9组,以Pb(0、0.01 mg/L和1 mg/L)和DBP(0、0.005 mg/L和0.5 mg/L)单独及联合对斑马鱼胚胎暴露120 h。观察、记录胚胎的孵化、死亡情况,采用荧光定量PCR测定斑马鱼胚胎神经发育相关基因(NR1A、NR2A、NR2D)和神经细胞凋亡相关基因(bcl-2、c-fos)的表达变化情况。与空白对照组相比,各暴露组均可致斑马鱼胚胎孵化率降低、死亡率增高(P<0.05);联合暴露组NR1A、NR2A、NR2D、c-fos基因表达水平显著升高,bcl-2基因表达水平显著下降(P<0.05)。Pb和DBP均可影响斑马鱼胚胎的发育,且具有一定的神经毒性,而二者联合暴露毒性复杂,对斑马鱼胚胎孵化率和死亡率的影响有交互作用,对神经发育和细胞凋亡相关基因无交互作用,其机制有待进一步研究。
铅;邻苯二甲酸二丁酯;联合暴露;斑马鱼胚胎;基因表达
铅(Pb)是一种普遍存在的环境有毒重金属污染物,可对机体内多个系统和器官造成损伤,并且能够在神经组织中蓄积,引起神经系统功能的长期损害。邻苯二甲酸二丁酯(dinbutyl phthalate,DBP)常作为增塑剂,添加在聚氯乙烯、聚醋酸乙烯酯、纤维素和聚氨酯中,同时其生成的化合物被广泛应用于密封胶、涂料、粘合剂、化妆品和食品包装等产品中。Pb和DBP都是常见的水体污染物,可通过工业废水排放等方式进入水体,在我国部分河流、水源均有检出[1,2]。两者可通过多种方式(如饮入、食入或皮肤直接接触等)暴露于人体。长期低剂量接触Pb和DBP可对人类和动物造成不同程度的损伤,尤其是神经系统方面[3,4]。多数文献报道集中于Pb和DBP单独暴露,关于它们联合暴露的毒性鲜有报道。斑马鱼是一种理想的模式生物,常用于毒性测试和毒理研究。本文以斑马鱼胚胎为实验对象,研究低浓度的Pb和DBP单独及联合暴露对斑马鱼胚胎神经和细胞凋亡相关基因表达的影响,以探讨Pb和DBP联合暴露对斑马鱼胚胎神经系统的毒性作用。
1 材料与方法
1.1材料
醋酸铅和DBP购自国药集团化学试剂有限公司; RNA提取试剂盒、RNA反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购于南京建成生物工程研究所;NR1A、NR2A、NR2D、bcl-2、c-fos和rpl13A引物由上海英俊生物技术有限公司合成;其他试剂均为分析纯。
实验用AB品系斑马鱼,亲本鱼购于国家斑马鱼资源中心。斑马鱼的养殖参照《Zebrafish Book》[5]对斑马鱼进行喂养、繁殖和培育,每日喂2次水虾(卤虫无节幼体)。幼鱼5月大后将雌雄鱼分开饲养。实验前1 d,将7~18月大的雌雄亲本鱼按比例放入到交配缸中(雌∶雄=1∶2),第2天早上取出隔板让雌雄斑马鱼自行交配,采集30 min内产下的受精卵。将胚胎置于恒温孵箱中,28.5℃孵育6 hpf(受精后6 h),备用。
1.2方法
1.2.1实验设计按3×3析因设计,实验分为9组。根据生活饮用水Pb限值0.01 mg/L,DBP限值0.003 mg/L[6],并结合本实验室的前期研究结果[7,8],各实验组的暴露剂量见表 1。
表1 Pb和DBP剂量
1.2.2斑马鱼胚胎试验将孵育6 hpf的斑马鱼胚胎置于6孔培养板,每孔20只,用去离子水洗净后,每孔加入500 μL工作液,每个剂量受试液设4个平行。分别在24 hpf、48 hpf、72 hpf和96 hpf 更换受试液,于120 hpf观察记录脱模后幼鱼的死亡数及幼鱼的孵化数,统计胚胎的死亡率和孵化率并收集幼鱼于-80℃冷冻备用。
1.2.3胚胎神经发育和凋亡相关基因表达采用Real-time PCR方法测定胚胎神经发育相关NR1A、NR2A、NR2D,凋亡相关bcl-2、c-fos以及管家基因rpl13A的表达水平。总RNA的提取和cDNA的合成:用Trizol法提取总RNA,紫外分光光度计测定总RNA浓度和RNA质量(A260/A280为1.8~2.0)。采用RNA反转录试剂盒,逆转录合成cDNA。实时定量PCR检测(引物序列见表2),SYBR 荧光实时定量 PCR 法测定 mRNA的表达情况。反应参数:95℃变性 30 s;95℃ 5 s,60℃ 30 s,40个循环。每个样本的RNA含量均根据各自的rpl13A含量进行标准化。目的基因表达数据采用2-△△Ct相对表达定量方法分析获得。
1.3统计学处理
表2 本研究所用引物序列
2 结果与分析
2.1Pb和DBP联合暴露对斑马鱼胚胎孵化率和死亡率影响
对斑马鱼胚胎发育情况一般观察,与空白对照组相比,低浓度的Pb和DBP对斑马鱼胚胎发育期间形态基本无影响,高浓度的DBP和联合暴露组,斑马鱼胚胎出现发育迟缓。如表3所示,Pb和DBP单独暴露组斑马鱼胚胎的孵化率随着暴露浓度的增加逐渐降低,死亡率随着暴露浓度的增加逐渐升高。与对照组相比,各暴露组(除Pb-L和DBP-L)可显著降低胚胎的孵化率,增加胚胎的死亡率(P<0.05);与Pb组和DBP组相比,Pb+DBP组中胚胎孵化降低,死亡率增加(P<0.05)。由表3可知,Pb和DBP联合暴露对斑马鱼胚胎孵化率和死亡率的影响存在交互作用且为协同作用(P<0.05)。
表3 Pb和DBP联合暴露对斑马鱼孵化率和死亡率的影响±s)
注:a:与空白对照组比较差异显著(P<0.05); b:Pb+DBP组与Pb组比较差异显著(P<0.05);c:Pb+DBP组与DBP组比较差异显著(P<0.05)。
表4 方差分析结果
2.2Pb和DBP联合暴露对斑马鱼胚胎 NMDA受体基因表达的影响
Pb和DBP单独和联合暴露对斑马鱼胚胎NR1A基因表达的影响见图1A。与对照组相比,各暴露组(除Pb-L、DBP-L和Pb-L+DBP-L)NR1A基因的表达水平显著增加(P<0.05);与Pb组相比,Pb-L+DBP-H和Pb-H+DBP-H组NR1A基因的表达水平显著增加(P<0.05);与DBP组相比,Pb-H+DBP-L 和Pb-H+DBP-H组的NR1A基因的表达水平显著增加(P<0.05)。
Pb和DBP单独和联合暴露对斑马鱼胚胎NR2A基因表达水平见图1B。与对照组相比,各暴露组(除Pb-L和DBP-L)NR2A基因的表达水平显著上升(P<0.05);与Pb组相比,Pb+DBP组(除Pb-H+DBP-L)NR2A基因的表达水平显著上升(P<0.05);与DBP组相比, Pb-H+DBP-L和Pb-H+DBP-H组NR2A基因的表达水平显著上升(P<0.05)。
Pb和DBP单独和联合暴露对斑马鱼胚胎NR2D基因表达水平见图1C。与对照组相比,Pb+DBP组(除Pb-L+DBP-L)NR2D基因表达水平显著增加(P<0.05);Pb-H+DBP-H组与Pb和DBP组相比,NR1A基因表达水平显著增加(P<0.05)。析因分析表明,Pb和DBP联合暴露对斑马鱼胚胎NR1A、NR2A和NR2D基因表达的影响不存在交互作用(P>0.05)。
图1 Pb和DBP联合暴露对斑马鱼胚胎NMDA受体基因表达水平的影响Fig.1 Effects of co-exposure to Pb and DBP on the expression level of NMDA receptor gene from zebrafish embryos.A:NR1A; B:NR2A; C:NR2D。a:与空白对照组比较差异显著(P<0.05); b:Pb+DBP组与Pb组比较差异显著(P<0.05);c:Pb+DBP组与DBP组比较差异显著(P<0.05)。
2.3斑马鱼胚胎凋亡相关基因表达水平的变化
Pb和DBP单独和联合暴露对斑马鱼胚胎bcl-2基因表达水平见图2A。与对照组相比,Pb-H、Pb-L+DBP-H、Pb-H+DBP-H组显著下调bcl-2基因表达水平(P<0.05);与Pb组相比,Pb-H+DBP-H组的bcl-2表达水平显著下降(P<0.05);与DBP组相比,Pb-L+DBP-H和Pb-H+DBP-H组的bcl-2表达水平显著下降(P<0.05)。
Pb和DBP单独和联合暴露对斑马鱼胚胎c-fos基因表达水平由2B可知。与对照组相比,各暴露组(除Pb-L和DBP-L)c-fos基因表达水平显著增高(P<0.05);与Pb组相比, Pb+DBP组(除Pb-H+DBP-L)的c-fos基因表达水平增加(P<0.05);与DBP组相比,Pb-H+DBP-H的c-fos基因表达水平显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05);析因分析表明,Pb和DBP联合暴露对斑马鱼胚胎bcl-2和c-fos的基因表达的影响不存在交互作用(P>0.05)。
图2 Pb及DBP对斑马鱼胚胎凋亡相关基因表达水平的影响Fig.2 Effects of co-exposure to Pb and DBP on the expression level of apoptosis-related genes from zebrafish embryos.A:bcl-2; B:c-fos。a:与空白对照组比较差异显著(P<0.05); b:Pb+DBP与Pb组比较差异显著(P<0.05);c:Pb+DBP与DBP组比较差异显著(P<0.05)。
3 讨论
研究表明Pb和DBP侵入生物体,会对神经中枢产生毒性作用,包括干扰神经递质、改变受体的密度、分布和功能,改变神经细胞的DNA代谢和释放以及诱导神经元细胞的凋亡等。目前,Pb和DBP的毒性研究主要集中在单一暴露。张小晶等[13]发现Pb对斑马鱼胚胎发育有明显的毒性作用且可引起神经细胞的损害。Chen等[14]发现0.1~1 mg/L的醋酸铅暴露于斑马鱼胚胎后可导致斑马鱼胚胎发育毒性,且可对成鱼的学习记忆能力造成一定的损伤;DBP(1 250 mg/L)暴露于斑马鱼,可引起斑马鱼的发育毒性[15]。本文采用荧光定量RT-PCR方法研究Pb和DBP暴露于斑马鱼胚胎对神经相关基因NR1A、NR2A和NR2D及细胞凋亡相关基因bcl-2和c-fos表达量的影响,首次研究了Pb和DBP的联合毒性,结果发现在单独暴露组中,随着暴露剂量升高,斑马鱼的孵化率逐渐降低,死亡率逐渐升高;斑马鱼单独暴露于低浓度的Pb(0.01 mg/L)和DBP(0.005 mg/L)死亡率低于10%,胚胎孵化率没有明显影响,而当Pb-L+DBP-L暴露时,斑马鱼胚胎死亡率达到18.75%,胚胎孵化率降至47.50%。说明DBP加强了Pb的毒性,且二者表现出协同作用。
谷氨酸NMDA(N-methyl-D-aspartate,N-甲基-D-天冬氨酸)受体基因是神经发育相关基因,在神经发育及学习记忆过程中起到至关重要的作用,其中NR1亚基是组成功能性的NMDA受体所必备的;NR2(包含NR2A~NR2D亚型)亚基为辅助NMDA受体形成多元化结构[16]。NR2A和NR2D表现出“双向调节”作用,低频刺激可被激活并对学习记忆产生增强作用,过度表达或激活,会出现谷氨酸兴奋性毒性反应,引起学习记忆受损的认知功能障碍。因此,通过NMDA受体的基因表达水平的变化,可以衡量不同化学物质的神经毒性作用。本实验的研究结果表明低浓度的Pb和DBP单独暴露不会引起NR1A、NR2A基因表达水平的显著变化,但是高浓度的Pb和DBP以及Pb+DBP联合暴露可以诱导斑马鱼胚胎NR1A、NR2A基因表达水平的增加;低浓度和高浓度Pb和DBP单独暴露不会引起NR2D基因表达水平显著变化,但Pb+DBP联合暴露可以上调斑马鱼胚胎NR2D基因表达水平。Pb和DBP单独和联合暴露可能通过影响神经发育相关基因的表达对斑马鱼胚胎产生神经毒性。NMDA受体对Ca2+有较高的通透性,被持续激活后Ca2+大量增加,引起Ca2+超载,最终导致神经元死亡;当神经系统发生病变时,NMDA受体过度激活可对神经组织造成不利影响[17]。本实验中Pb和DBP联合暴露诱导NR1A、NR2A和NR2D上调,可能是由于NMDA受体被过度激活。有文献报道[18]0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、2.5 μmol/L和12.5 μmol/L剂量的Pb暴露于斑马鱼胚胎醋酸,发现Pb可上调NR1.1、NR1.2和NR2BmRNA的表达,改变了正常的NMDA受体表达规律,与本文研究结果一致。
bcl-2和c-fos均为细胞凋亡相关基因,其表达与突触活动相关并在长期记忆形成和巩固中起着重要作用[19]。bcl-2为抑凋亡基因,c-fos为促凋亡基因,在细胞凋亡中起重要作用,发育早期神经元细胞凋亡可导致神经毒性。本文研究结果表明,低浓度的Pb和DBP单独暴露不会引起bcl-2和c-fos基因表达水平显著变化,但是高浓度的Pb和DBP以及Pb+DBP联合暴露可以诱导斑马鱼神经细胞凋亡相关基因bcl-2表达量下降,高浓度的Pb以及Pb+DBP联合暴露可以诱导c-fos表达量上升,且无交互作用。提示DBP和Pb联合暴露增强了Pb对斑马鱼胚胎bcl-2和c-fos基因表达的影响,Pb和DBP单独和联合暴露可能通过影响神经胚胎细胞凋亡相关基因的表达,产生神经毒性。多种刺激均可诱导中枢神经系统(CNS)中c-fos基因的表达,c-fos不恰当的表达或突变可诱发细胞凋亡,诱导其表达的相关机制主要与NMDA、NO、Ca2+和γ-氨基丁酸(GABA)等因素有关[20]。bcl-2在细胞凋亡中起抗凋亡作用,但被酶解后失去了抗凋亡的作用,加速了细胞凋亡;当bcl-2表达降低时,使线粒体跨膜电位耗散并释放细胞色素C和凋亡诱导因子[21]。由此推测,通过下调bcl-2基因表达,上调c-fos基因表达水平可抑制细胞增殖诱导细胞凋亡。有文献报道[22],Pb暴露使斑马鱼胚胎的bcl-2表达水平下调,c-fos基因表达水平上升,诱导细胞凋亡发生,这与本文研究结果一致。
综上所述,Pb和DBP暴露对斑马鱼胚胎死亡率和孵化率均具有一定的影响且联合暴露存在协同作用。低浓度的Pb和DBP单独暴露对NMDA受体以及凋亡相关基因bcl-2和c-fos影响很小,但是联合暴露组对NR1A、NR2A、NR2D、bcl-2和c-fos有显著影响。说明二者均可影响斑马鱼胚胎的发育,且具有一定的神经毒性,而二者联合暴露毒性复杂,无交互作用,其致毒的机制有待进一步研究。
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Effect of Combined Exposure of Lead and Dibutyl Phthalate on Embryo of Zebra Fish (Daniorerio)
LIU Hong-yang1, MAO Guang-hua1, XU Hai1, FENG Wei-wei1, ZHAO Ting2, DING Yang-yang2, CHEN Yao1, YANG Liu-qing2, WU Xiang-yang1*
1.SchooloftheEnvironmentandSafetyEngineering,JiangsuUniversity,JiangsuZhenjiang212013,China;2.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,JiangsuUniversity,JiangsuZhenjiang212013,China
The aim of the research was to study the effect of individual and combined exposure to lead (Pb)and dinbutyl phthalate(DBP) on the neurological and apoptosis-related gene expressions, and the effect on the nervous system of zebra fish embryos. According to the 3×3 factorial design, 720 zebra fish embryos were randomly divided into 9 groups, Pb (0, 0.01 mg/L,1 mg/L) and DBP (0, 0.005 mg/L,0.5 mg/L) were administered individually and mixtures to zebra fish embryos for 120 h, hatchability and mortality were record. Quantitative real-time PCR was used to assess neurological gene (NR1A,NR2A,NR2D) and apoptosis-related gene (bcl-2,c-fos) expressions. Exposure to individual and combined of Pb and DBP could cause decrease in hatchability and increase in mortality. There was an interaction between Pb and DBP on hatchability and mortality(P<0.05). Co-exposure to Pb and DBP up-regulatedNR1A,NR2A,NR2D,c-fosgene and down-regulatedbcl-2 gene (P<0.05). Exposure to Pb and DBP could impaire the development of zebra fish embryos and cause a certain neurotoxicity. The joint toxicity of them was complicated. It has interaction effect on the hatching rate and mortality and no interaction on neurological gene and apoptosis related genes of zebra fish embryos. The mechanism needs to be further studied.
lead; dibutyl phthalate; combined exposure; embryo ofDaniorerio; gene expression
10.3969/j.issn.2095-2341.2016.04.05
2016-04-08; 接受日期:2016-04-28
江苏高校协同创新中心计划资助。
刘红阳,硕士研究生,主要从事环境化学相关研究。E-mail: 405389805@qq.com。*通信作者:吴向阳,教授,博士生导师,主要从事环境化学、水污染控制和农业资源高效利用等研究。E-mail:wuxy@ujs.edu.cn