一株大麻雨露脱胶真菌的分离鉴定及其脱胶性能研究

杨庆丽,　刘宇峰,　夏尊民,　石　杰

黑龙江省科学院大庆分院, 黑龙江 大庆 163319



一株大麻雨露脱胶真菌的分离鉴定及其脱胶性能研究

杨庆丽,刘宇峰*,夏尊民,石杰

黑龙江省科学院大庆分院, 黑龙江 大庆 163319

从大麻根部土壤中分离一株能够以大麻茎粉为唯一碳源生长的真菌。经18S rRNA鉴定此菌为链格孢属。采用GB/T18147.2-2008和DNS法对大麻茎残胶率及真菌果胶酶活性进行分析。将此菌应用于田间试验，对施用本菌的沤麻周期、大麻出麻率及纤维强度进行研究。结果表明此菌具有产果胶酶活性但能力较低仅为150.5 U/mL，能够降解胶质释放大麻纤维，田间雨露沤麻时施用本菌可以加快沤麻速度，出麻率及大麻纤维强度分别提高了1.73%和17.01%。应用此菌沤麻可缩短沤麻周期，提高大麻出麻率及纤维质量，具有较好的应用前景。

大麻；雨露脱胶；真菌

大麻纤维性能优异，具有卫生耐用、抗菌防臭、吸汗透气、防静电及防紫外线等特点，被广泛应用于建筑、服装、家纺等行业中，是一种绿色环保的纤维原料，有广阔的应用前景[1,2]。我国有悠久的大麻种植历史，约占世界总产量的三分之一，居世界首位[3]。大麻种植的经济效益与纤维的质量及产量直接相关。脱胶又是影响大麻纤维质量和产量的决定性因素[4]。因此，脱胶好坏直接影响着大麻种植的经济效益。目前，最常用的大麻脱胶方法为天然雨露沤麻，此方法具有省时省力、经济环保等优点，得到了广泛的应用。但是在实际应用中也存在许多不足之处。首先，研究表明天然雨露沤麻中起降解作用的主要是生长较慢的真菌[5]，天然接菌使得沤麻周期较长，纤维降解菌等杂菌会共同生长从而影响纤维质量。其次，北方地区大麻收割期为8月末至9月初，气温较低不利于沤麻，若周期过长则易出现沤麻不完全的问题影响纤维产量。这说明缩短沤麻周期对于提高大麻种植效益非常重要。本研究目的为筛选一株可应用于大麻雨露脱胶的微生物，在田间实验中将此微生物直接接种到大麻茎上，并对沤麻周期、得麻率和纤维强力等进行研究，以期解决大麻天然雨露脱胶中出现的问题，为提高大麻纤维的质量及产量提供帮助。

1　材料与方法

1.1试验材料

试验土样为大麻根部土壤，田间试验大麻品种为“火麻一号”，麻样取自收割后的种子田。地点为黑龙江省科学院大庆分院肇州大庆种植基地。果胶购自北京Kebio生物技术有限公司；半乳糖醛酸购自Sigma公司；DNS试剂自配；其他试剂均采用国产分析纯。

1.2培养基及培养条件

筛选培养基为大麻茎粉培养基(L)：大麻茎粉5 g，NH4NO31 g，NaCl 0.5 g，MgSO40.5 g，K2HPO41 g，FeSO40.01 g， pH 7.2[6]；分离、纯化采用马铃薯葡萄糖培养基；果胶培养基：以5 g果胶代替上述培养基中的大麻茎粉，其他无机成分相同；固体培养基中加入15 g琼脂，121℃灭菌30 min。

1.3试验方法

1.3.1脱胶菌的分离纯化取1 g土样加入到100 mL大麻茎粉无机培养基中，设3个重复。28℃培养7 d后，取上清培养液1 mL接种到100 mL大麻茎粉无机培养基中，连续培养3代。培养液上清稀释后涂布到马铃薯葡萄糖培养基平板上，根据菌丝形态及颜色的差异分别接种到马铃薯葡萄糖平板上继续纯化培养，纯化后接种到马铃薯葡萄糖斜面上编号保藏。

1.3.2果胶降解圈试验将上述试验中纯化的1株优势真菌接种于果胶固体平板上，28℃培养7 d，用1 g/L刚果红溶液染色1 h，之后用1 mol/L NaCl溶液脱色1 h，脱色后放入4℃冰箱过夜，测量透明圈(H)及菌落(C)直径。

1.3.3果胶酶活分析取上述优势真菌接种到100 mL果胶培养基中28℃培养7 d，重复3次培养后取培养液10 mL，4℃ 9 000 r/min离心30 min，上清即为粗酶液。DNS法测果胶酶活性，活力单位以U/mL表示，即：

其中U：酶活力单位(U/mL)；G：酶解液中还原糖含量(μg);N：粗酶液稀释倍数；V：加粗酶液量(mL)；t：作用时间(min)。

1.3.4大麻茎残胶率测定取肉眼无可见真菌生长的大麻茎截成10cm左右小段，放入500mL三角瓶中，每瓶20根，灭菌。取优势真菌马铃薯葡萄糖培养液1mL，与30mL灭菌蒸馏水充分混合，之后接种到装有大麻茎的三角瓶中，摇晃三角瓶使菌接种到大麻茎上，设3个重复。以仅加入同等体积灭菌蒸馏水为空白对照。室温(约23℃)沤麻7d后采用GB/T18147.2-2008法测定残胶率，感官法评定大麻木质部与韧皮部的分离度。

1.3.5菌种鉴定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3.6田间试验实验组为先将优势真菌用马铃薯葡萄糖液体培养基扩大培养，之后与自来水按一定比例配合后喷施于收割后平铺地面的大麻茎表面；对照组为仅喷施自来水。两组试验条件完全相同。

2　结果与分析

2.1菌种分离筛选

天然雨露沤麻微生物主要来自于周围环境，土壤是重要来源之一。本研究以大麻根际土壤为实验材料，以大麻茎粉为唯一碳源分离筛选大麻脱胶微生物。根据微生物在培养基平板上的不同形态及颜色，初筛共获得微生物10株，其中真菌6株，细菌4株。初筛微生物包括大麻脱胶菌及耐受菌，需对其进行大麻脱胶能力分析，才能获得真正的大麻脱胶菌。由于样本较多，本研究首先选取其中1株优势真菌Na-TTP(以下简称TTP)进行下一步研究。

TTP为好养真菌，在大麻茎粉液体培养基中生长较快，菌体相互紧密结合成片状飘浮于培养基表面。PDA平板上生长迅速，25～28℃条件下培养7d菌落直径达8cm左右。菌落呈绒毛状，圆形等径生长，培养初期为灰白色，后逐渐呈现深褐色，表面有水滴，菌落形态见图1(彩图见图版一)。

2.2菌种分子生物鉴定

经生工生物(上海)股份有限公司鉴定，真菌TTP18SrRNA片段全长1 311bp。通过NCBI中BLAST比对获得相似性最高的前10个序列，以MAGE6软件分析TTP系统发育树。结果见图2。由图可见，Na-TTP与链格孢AltB相似度达100%，与链格孢B13，HDJZ-ZWM-06相似度为99.9%，其他均为99.5%以上，结合菌落形态分析鉴定TTP为链格孢属(Alternariasp.)。

图1　大麻脱胶真菌 TTPFig.1　Hemp degumming fungus TTP.(彩图见图版一)

图2　TTP与相似菌株的18S rDNA聚类分析图Fig.2　Clustering analysis of 18S rDNA of TTP and related fungus.

2.3脱胶能力初步研究

果胶是大麻胶质的主要组成成分，微生物果胶降解能力的高低是其大麻脱胶能力的评定标准之一。因此，产果胶酶活性是大麻脱胶菌的筛选的重要指标。本研究采用果胶透明圈法及DNS法对TTP产果胶酶活性进行分析。透明圈法是指TTP如果能够产生果胶酶，菌落周围的果胶被其降解，使得刚果红无法染色而形成透明圈，未被降解的平板则被染上红色。产酶能力越强果胶降解越多，透明圈越向外扩展。图3(彩图见图版一)可见TTP可以形成果胶透明圈。表1中，TTP透明圈直径为2.77 cm，菌落大小为2.27 cm，透明圈与菌落直径的比值 HC 为1.22。培养7 d，TTP果胶酶活性为150.5 U/mL。以上可见，此菌产果胶酶活性不高。大麻茎接种TTP沤麻7 d后，木质部与韧皮部分离较好，残胶率低于对照组6.39%。表明真菌TTP具有较好大麻脱胶能力。此菌果胶酶活低又具有较高脱胶能力的原因，可能是由于大麻胶质是极为复杂的复合物，脱胶的好坏并不一定完全取决于果胶的降解能力。

图3　真菌TTP果胶降解圈Fig.3　Pectin degradation circle of TTP.(彩图见图版一)

降解圈(H/C)果胶酶活(U)分离度残胶率(%)对照组(CK)--差29.37真菌组(TTP)1.22150.5好22.98

2.4田间试验

雨露脱胶是指大麻收割后平铺于地面，经雨露浸润微生物生长而天然脱胶的一种沤麻方法。此法受环境因素影响极大。另外，获得脱胶微生物的最终目的是进行田间应用，以提高大麻的种植效益。因此，仅通过室内模拟实验无法真正确定TTP的脱胶能力。本研究通过田间实验，将此菌人工接种到新收割的大麻茎上，分析此菌对沤麻周期、得麻率及纤维强力的影响，进一步确定TTP的脱胶性能。

表2可见，实验组与对照组相比大麻天然沤麻周期缩短了23.07%，出麻率及纤维强度分别提高1.73%及17.01%。表明此菌可以提高大麻纤维的质量和产量,有较高的实际应用价值。

表2　田间试验结果

3　讨论

随着国家对环境保护力度的加强，能耗高、污染大的温水沤麻逐渐被能耗低、污染小的雨露沤麻所取代，雨露沤麻中的关键阶段为微生物脱胶。因此，针对大麻脱胶微生物的相关研究也得到了越来越多的重视。如汪学军等[7]从大麻茎中分离出一株脱胶内生真菌，经鉴定与点霉属(Phomasp.)相似度高达99%。谭晓明[8]筛选出一株有高果胶酶活及低纤维素酶活的大麻脱胶芽孢杆菌(Bacillussp.)。杜格列夫和赫娃道夫斯基研究表明，链格孢(Alternariasp.)是西伯利亚雨露沤麻微生物区系中最重要的组成成分之一[9]。

本研究分离的大麻脱胶菌TTP经鉴定为链格孢属，是全球分布最广，有重要经济作用的无性型真菌，具有广泛的植物宿主[10]。结果表明TTP能够降解大麻茎胶质，促进木质部与韧皮部的分离，在缩短沤麻周期的同时，能有效提高大麻纤维的产量及质量，是一株有实际应用价值的真菌。此研究中也存在一些相关问题，由于试验进度的原因，本次研究中应用的大麻茎取自收获后的种子田，使得对照组及实验组出麻率及纤维强力均偏低；另外，由于气温较低沤麻周期总体较长。因此，本研究下一步的工作重点是进行大麻纤维田的田间试验，对实验数据进行进一步的验证。

[1]于文杰，王贵宾，韩 洁,等. 大麻脱胶功能菌株在沤麻中的应用[J]. 湖北农业科学, 2012, 51(21): 4772-4775.

[2]Arnaud L, Gourlay E. Experimental study of parameters influencing mechanical properties of hemp concretes[J]. Construct. Build. Materials, 2012, 28(1): 50-56.

[3]Alaru M, Kukk L, Olt J,etal.. Lignin content and briquette quality of different fibre hemp plant types and energy sunflower[J]. Field Crops Res., 2011, 124(3): 332-339.

[4]彭源德，严 理，唐守伟,等. 亚大麻快速生物脱胶过程中发酵液成分变化[J]. 纺织学报, 2009, 30(3): 48-52.

[5]汪学军，闵长莉，杨 艳,等. 大麻微生物脱胶特异放线菌菌株的筛选与鉴定[J]. 纺织学报, 2014, 35(11): 102-106.

[6]董政娥，丁若垚，郑 磊,等. 亚麻粗纱碱性脱胶菌株的筛选鉴定及脱胶效果[J]. 印染助剂, 2013, 30(10): 16-19.

[7]汪学军，闵长莉，殷志超. 一株具有脱胶功能大麻内生真菌的分离和鉴定[J].西北植物学报, 2014, 34(3): 623-627.

[8]谭晓明. 大麻微生物脱胶菌种选育及脱胶工艺研究[D]. 济南: 山东大学, 硕士学位论文, 2010.

[9]王贵宾. 大麻脱胶功能菌株的选育及在沤麻中的应用[D]. 哈尔滨: 黑龙江大学,硕士学位论文, 2009.

[10]冉俊祥，肖杰文，杨占臣,等. 美国大豆中链格孢的分离鉴定研究[J]. 植物检测, 2011，25(3): 17-22.

Isolation, Identification and Retting Ability of a Hemp Dew-retting Fungus

YANG Qing-li, LIU Yu-feng*, XIA Zun-min, SHI Jie

DaqingBranchofHeilongjiangAcademyofSciences,HeilongjiangDaqing163319,China

A dew-retting fungus with hemp stalk powder as the sole carbon source was isolated from hemp root soil. The fungus was determined to beAlternariasp. through 18S rRNA analysis. GB/T18147.2-2008 and the DNS methods were used to analyze its pectin enzyme activity and the hemp stem gum content. Fibre percentage, strength and retting time were researched after field application. Results showed pectin enzyme activity of the fungus was only 150.5 U/mL, the fungus could degrade pectin and release the hemp fiber, and speedup dew-retting. Fibre percentage and strength were 1.73% and 17.01% higher than CK. The fungus could shorten the retting period, improve the rate of hemp hemp and fiber quality, which has bright application prospects in the future.

hemp; dew-retting; fungus

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.04.07

2016-03-23; 接受日期：2016-05-17

黑龙江省应用技术研究与开发计划项目(GC13B209)资助。

杨庆丽，硕士研究生，研究方向为微生物。E-mail:qingliqingli@126.com。*通信作者：刘宇峰，研究员，研究方向为微生物。E-mail: 384751172@qq.com