一株陆生耐盐珊瑚球菌次生代谢产物的研究

黄　艳,　朱红惠

1.广东省微生物研究所, 华南应用微生物国家重点实验室; 广东省微生物菌种保藏与应用重点实验室; 广东省微生物应用新技术公共实验室, 广州 510070;2.佛山市海天(高明)调味食品股份有限公司, 广东 佛山 528511



一株陆生耐盐珊瑚球菌次生代谢产物的研究

黄艳1,2,朱红惠1*

1.广东省微生物研究所, 华南应用微生物国家重点实验室; 广东省微生物菌种保藏与应用重点实验室; 广东省微生物应用新技术公共实验室, 广州 510070;2.佛山市海天(高明)调味食品股份有限公司, 广东 佛山 528511

研究了陆生耐盐珊瑚球菌(Coralloccus)5X1发酵液经乙酸乙酯萃取后的化学成分,以期得到有活性的先导化合物。采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、高效液相色谱等方法进行分离纯化,通过理化性质和波谱数据分析鉴定化合物的结构。结果显示，从陆生耐盐珊瑚球菌5X1的乙酸乙酯萃取物中分离得到3个化合物,分别鉴定为环(酪氨酸-脯氨酸)、环(苯丙氨酸-脯氨酸)和乙酰基苯乙胺。这3种化合物均为首次从陆生耐盐珊瑚球菌5X1中分离得到。

耐盐珊瑚球菌；次生代谢产物；环二肽

目前，对常规环境粘细菌的研究较多，特殊生境粘细菌的研究较少。随着粘细菌研究的不断深入，1998年陆续发现海洋嗜盐和耐盐粘细菌以来，海洋粘细菌(marine myxobacteria)逐步被研究者们认可并密切关注，对不同生境下的粘细菌研究力度不断加强[1]，特别是特殊生境下的粘细菌研究。Reichenbach[2]在1992年的研究报道中指出：陆生粘细菌不能在含盐量为1%的环境下生长，使陆生环境下耐盐粘细菌的研究不被重视，且是否存在远离海洋的陆生耐盐粘细菌一直饱受争议。近50年来，被开发作新的抗生素产生菌的只有蓝细菌和粘细菌，粘细菌中发现了100余种全新结构的次级代谢产物和 600多种新的结构衍生物，成为继放线菌后的第二大抗生素产生菌[3]。粘细菌的次生代谢产物研究主要以堆囊菌属(Sorangium)和粘球菌属(Myxococcus)为主，对于占目前粘细菌分离比例约为23.1%的珊瑚球菌属(Corallococcus)的次生代谢产物的研究报道寥寥无几[4]。鞠培殿[5]对Corallococcuscoralloides085B04的研究得到了几个结构新颖并具有良好的抗肿瘤活性的新化合物。此粘细菌并非特殊生境粘细菌，同样表现出次生代谢产物多样性。粘细菌是一类具有社会性行为的细菌类群，拥有庞大的基因组，大小从5M～14.78Mbp不等，大基因组赋予粘细菌广泛的环境适应性和天然产物多样性。作为生命存在的形式之一，微生物为了适应极端环境的生存条件，在长期进化过程中形成了独特的防御机制，因此能够产生与常规环境微生物不同的次生代谢产物[6]。

本实验室长期从事粘细菌的研究工作，从新疆盐碱地环境分离得到一株陆生耐盐粘细菌[7]，能够在含2.5%的NaCl环境下生存。鉴于粘细菌具备天然产物多样性，且该菌株具备耐盐性，本文以该陆生耐盐粘细菌为研究对象，对其发酵条件中的盐浓度、次生代谢产物进行研究，以期拓宽特殊生境粘细菌次生代谢产物的研究领域。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1主要仪器与试剂Bruker公司核磁共振波谱仪(500 MHz AVANCE Ⅲ型)，Waters公司质谱分析仪(Acquity UPLC-Q-Tof Micro)，Thermo Finngan公司气相色谱-质谱联用仪(Trace DSQ)，武汉瑞华仪器设备有限公司大容量旋转式普通摇床(PZ1000B)，上海亚荣生化仪器厂旋转蒸发仪(RE-2000型)。青岛海洋化工厂柱层析用硅胶(100～200目、200～300目)，Merck公司高效薄层硅胶板(Silica gel 60 F254)，月旭科技HPLC制备柱(Welch)：21.2 mm×250 mm，10-Micron，三秦科技Flash Chromatographic Cdumns，Sepa Flash:40～63 μm Silica Gel。色谱纯甲醇(NCNW)，其他溶剂及试剂购自广州化学试剂厂，均为分析纯。

1.1.2菌种陆生耐盐粘细菌，编号5X1由本实验室分离获得。

1.1.3培养基：CY培养基：Tryptone 3.0 g，Yeast Extact 1.0 g，CaCl2·2H2O 1.0 g，加水定溶至1 L，pH 7.2。

1.2方法

1.2.1确定发酵最适含盐度陆生耐盐粘细菌的培养，以CY培养基作为菌株生长基础培养基，在此基础上，添加不同浓度的NaCl(0%，0.5%，1%，1.5%，2%)，每个处理3个平行。用分光光度计OD600的吸收值测量粘细菌菌体密度，震荡摇匀后测量以确保菌悬液均一。此外，采用乙酸乙酯萃取发酵液后的初膏得率和离心后干菌体得率进一步选择最佳发酵盐浓度。将不同含盐量的发酵液各处理分别合并、离心，收集菌体，低温烘干，测干菌体得率；离心后的上清用等体积的乙酸乙酯萃取3次，旋转蒸发仪浓缩后，称量测得发酵液初膏得率。

1.2.2确定发酵最适温度在上述粘细菌发酵最适含盐度的基础上，尽可能确保相同接种量，分别在30℃、33℃、35℃、37℃条件下培养，观察菌体生长情况，测量各温度下菌悬液的OD600吸收值。

1.2.3种子培养在最适含盐度和最适温度条件下，在CY培养基中接入菌体，震荡培养3 d,作为种子液。

1.2.4发酵陆生耐盐珊瑚球菌的培养：将加入最适盐含量的CY液体培养基分装，500 mL三角瓶中装200 mL，1 000 mL三角瓶中装400 mL，取适量种子液接种于发酵培养基中，在最适温度下震荡培养7 d。

1.2.5提取分离将培养好的发酵液经4 000 r/min 离心，将菌体及上清分离，上清用等体积的乙酸乙酯萃取3次，浓缩乙酸乙酯相，得到乙酸乙酯萃取的粗提物。经过制备型硅胶柱粗分，再经高压制备型C18柱分离。

1.2.6粘细菌的分子生物学鉴定采用CTAB法抽提粘细菌总DNA；用细菌通用引物27F和1492R对粘细菌菌株总DNA进行16S rRNA基因扩增[8,9]，PCR产物送到上海英骏生物公司广州分公司测序。将所得序列在EzTaxon(http://www.eztaxon.org/)数据库中进行对比，使用Mega 4.1构建系统进化树以确定其归属。

2　结果与分析

2.1最适发酵盐浓度的确定

如图1所示，通过菌悬液吸光值的测定、初膏得率和干菌体得率的数据测定，得出发酵液OD600吸收值1%NaCl达到最大值(图1A)，初膏得率2%NaCl时达到最大值(图1B)，干菌体得率在1%NaCl达到最大值(图1C)，综合来看，最终确定1%为最佳NaCl浓度。

图1　不同浓度的氯化钠对5X1生长的影响Fig.1　Effect of different NaCl concentration on the growth of 5X1.A：发酵液OD600吸收值；B：发酵浸膏得率；C:干菌体得率

2.2最适发酵温度的确定

陆生耐盐珊瑚球菌在不同温度条件下培养，菌悬液OD600吸收值有一定的差异。在不同时间段发酵液的培养状态不同，如表1所示。将陆生耐盐珊瑚球菌在不同温度下培养3 d后，在OD600下测定吸光度值如图2所示，33℃培养条件下，OD600吸收值最大，与肉眼观察结果相一致，说明33℃最适合菌体生长。因而，确定陆生耐盐珊瑚球菌发酵的最佳培养温度为33℃。

2.3化合物的结构鉴定

经中压制备色谱的快速制备型硅胶柱进行粗分离，制备液相分离条件见表2，对其中的四号段进行HPLC分析，再由高压制备色谱的C18柱分离得到2个环二肽，均为已知化合物。化合物Ⅰ，白色粉末状样品(甲醇),碘熏蒸后显黄色，印三酮表现为负反应，用6 mol/L盐酸水解后呈红色，呈阳性反应[8]，化合物Ⅰ、Ⅱ的核磁共振图谱分析数据(图3)与文献[9]中的分析数据基本一致，化合物Ⅲ：无色油状样品，易溶于甲醇，与文献[10]中的分析数据基本一致。根据NMR波谱数据，及高分辨质谱数据鉴定为环(酪氨酸-脯氨酸)cyclo-(Tyr-Pro)，环(苯丙氨酸-脯氨酸)cyclo-(phe-Pro)，乙酰基苯乙胺，3个化合物的结构见图4。

图2　不同温度下菌体第3天的生长情况Fig.2　Effect of different temperatures on the growth of 5X1 on the 3rd day.

发酵温度发酵时间发酵液状态描述30℃48～60h云雾状,发酵液呈淡黄色>60h球状菌体,发酵液颜色加深33℃24h云雾状,发酵液呈淡黄色36～48h球状菌体,发酵液呈深黄色35℃48～60h云雾状,发酵液呈淡黄色>60h球状菌体,发酵液颜色加深37℃>60h少量菌体,发酵液色浅>96h少量菌体,不成球状,发酵液呈淡黄色

2.45X1菌株鉴定结果

将测序结果进行同源序列对比分析后可见，粘细菌的16S rDNA序列与CorallococcusmacrosporesDSM 14697T同源性最为相近，但又显示与粘球菌属具有较近的亲缘关系。这主要是因为2007年Corallococcus才由粘球菌属分离出来。根据该菌株形态特征和分子生物学分析结果，初步鉴定该粘细菌为Corallococcussp.。

表2　化合物的分离纯化条件

图3　3种化合物在HPLC分析图谱Fig.3　HPLC chromatography of three compounds.A:化合物Ⅰ;B:化合物Ⅱ：C:化合物Ⅲ

图4　3种化合物的结构式Fig.4　The structure of three compounds.

图5　菌株5X1系统进化树Fig.5　Phylogenetic tree of strain 5X1.

3　讨论

本文对特殊生境下陆生耐盐粘细菌5X1的最佳发酵条件和发酵液经由乙酸乙酯萃取后的化学成分进行研究，目前共鉴定出2个环二肽类化合物和乙酰基苯乙胺，为粘细菌珊瑚球菌属中首次分离得到。微生物的次生代谢产物的形成与培养基成分具也有一定相关性。本试验中3种化合物的分离纯化条件是粘细菌5X1在添加1%NaCl的 CY培养基上，33℃条件下液态发酵后，经乙酸乙酯萃取进一步分离纯化得到的。经过分子生物学初步鉴定粘细菌5X1为珊瑚球菌属。但陆生耐盐珊瑚球菌5X1的次生代谢产物绝不限于上述3种化合物，其他组分由于纯度、含量等问题未能够进一步完成化合物的结构鉴定，后期仍需深入研究。

近年来对微生物次生代谢产物的研究表明，环二肽类在多种微生物中均有分离获得，并显现出多种生物活性[11]。随着研究的不断深入发现环二肽作为重要的信号分子在信息传递方面扮演着重要的角色。本文中分离得到的2种环二肽具有抑菌活性[12],还具有诱导生物发光和色素产生的活性[13]，这可能与该珊瑚球菌培养过程中形成的鲜艳的橙色有关。此外，已报道这2种环二肽在信号传递过程中具有重要的作用[14]，这2个环二肽首次在陆生耐盐粘细菌中发现，对于粘细菌子实体的形成时期细胞聚集等方面的研究具有重要意义，同时，环(酪氨酸-脯氨酸)和环(苯丙氨酸-脯氨酸)除在海洋生物中共同发现外，还存在于共生生物中。这对粘细菌群感效应的研究也有一定的参考价值。

系统发育比较分析显示，海洋粘细菌序列与陆地粘细菌显著不同,并在高分类水平(科)表现出明显的种群地理分布特征[15]。本试验中分离得到的环二肽曾被共同分离于海洋细菌[16,17]，林永成[18]和王书锦[19]认为海洋细菌具有产生环肽类化合物的倾向，乙酰基苯乙胺也多分离自海洋生物，如软珊瑚、红树林植物土壤的微生物。环(酪氨酸-脯氨酸)和环(苯丙氨酸-脯氨酸)和乙酰基苯乙胺共同多见于海洋生物代谢产物中。但海洋粘细菌与陆生粘细菌在系统发育方面的显著不同表现出种群地理分布差异性，陆生耐盐珊瑚球菌5X1却表现出一定的耐盐性，这可能是由于上述环二肽和乙酰基苯乙胺在信号传递中的影响有关。是否具备生成以上3种代谢产物的微生物具备一定的耐盐性？此问题还需进一步展开基因组学和系统发育组学的研究，以寻找陆生耐盐粘细菌、海洋粘细菌与普通陆生非耐盐粘细菌的进化关系。

特殊生境陆生耐盐粘细菌的研究为粘细菌次生代谢产物的研究打开了新的篇章，本文证实了远离海洋的陆生粘细菌具备耐盐性，该生境下的粘细菌值得深入研究。

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Study of the Secondary Metabolism from Salt-tolerantCoralloccusmacrosporus

HUANG Yan1,2, ZHU Hong-hui1*

1.StateKeyLaboratoryofAppliedMicrobiologySouthernChina;GuangdongProvincialKeyLaboratoryofMicrobialCultureCollectionandApplication;GuangdongOpenLaboratoryofAppliedMicrobiology,GuangdongInstituteofMicrobiology,Guangzhou510070,China;2.Foshan Haitian (Gaoming) Flavouring & Food Co., LTD., Guangdong Foshan 528511, China

Inordertoisolateandidentifytheactivatedleadcompound,westudiedthechemicalconstituentsfromsalt-tolerantCoralloccus 5X1thatextractedbyethylacetate.Thecompoundswereisolatedbysilicagelcolumn,Sepha-dexLH-20columnchromatographyandHPLCtechniques.Andthesecompoundswereidentifiedbythephysico-chemicalpropertiesandspectralanalysis.Theresultsshowedthattherewerethreecompoundsisolatedfromtheethylacetateextractsofsalt-tolerantCoralloccus 5X1.Theywereidentifiedascyclo(Tyr-Pro),cyclo(Phe-Pro)andN-(2-phenylethyl)-acetamide.AllofthecompoundswereisolatedfromCoralloccusforthefirsttime.

salt-tolerantCoralloccus;secondarymetabolism;cyclo-dipeptide

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.04.09

2016-03-16; 接受日期：2016-04-04

国家自然科学基金项目(31170009；31470141)；广东省科技攻关项目(2012B050700009)资助。

黄艳，工程师，研发方向为微生物发酵和过程控制。E-mail:huang.yan14@qq.com。*通信作者：朱红惠，研究员，博士，研究方向为微生物资源的挖掘、保藏及应用。E-mail:zhuhh@gdim.cn