茅苍术对H9c2心肌细胞氧化损伤的保护作用

杨嘉永　刘碧丽



【实验研究】

茅苍术对H9c2心肌细胞氧化损伤的保护作用

杨嘉永刘碧丽

厦门大学附属第一医院药学部(厦门 361003)

摘要：目的茅苍术水煎液和它的含药血清对H9c2该细胞的保护效果的研究。方法采用双氧水制造 H9c2 大鼠心肌细胞的氧化损伤模型，以Vc为阳性对照，通过对受损心肌细胞形态学观测、SOD活力检测及细胞相对凋亡情况的检测，测定茅苍术水煎液和它的含药血清对H9c2细胞的保护效果。结果不同浓度的茅苍术水煎液均使细胞生长状态得以改善，外部形态明显好转。高剂量组细胞生长较好，中剂量组次之，低剂量组较差；茅苍术水煎液组 LDH 释放量和MDA 含量明显低于 Vc 对照组，SOD 活力明显高于损伤组；细胞的相对存活率随着茅苍术水提液的浓度升高而明显增大，分别为72.37%、66.19%、55.44%，低剂量组的茅苍术水提液对 H2O2 损伤的 H9c2 心肌细胞的保护作用不明显。结论茅苍术水提液的保护作用机制与增强细胞抗氧化能力、减少自由基和脂质过氧化物导致的细胞膜损伤有关。

关键词：茅苍术；H9c2心肌细胞；保护作用

茅苍术Atractylodeslancea为常用中药，在我国有悠久的临床应用历史，因其主要成分挥发油过量对人体有明显的不良作用，因此研究其水溶性成分是当务之急。本研究采用双氧水制造H9c2大鼠心肌细胞的氧化损伤模型，以Vc为阳性对照，测定茅苍术水煎液和它的含药血清对H9c2细胞的保护效果，以期达到评价其抗氧化作用的效果，找出发挥抗氧化的药效物质，为茅苍术进一步药效物质基础的阐明提供理论依据。

1　材料与设备

1.1实验仪器CO2细胞培养箱：MCO-20AIC型，日本三洋SANYO；倒置显微镜：CKX31型，日本奥林巴斯OLYMPUS；全自动灭菌锅：ES315型，日本TOMY；高速冷冻离心机：5811U型，德国Eppenodorf公司；超纯水制备系统：Synergy型，美国密理博Millipore；水浴锅：HR-06型，Guohua公司； 10,100,1000 μL微量加样器：Eppendorf，Germany；酶标仪：ELX800，BioTek，USA；H9c2大鼠心肌细胞株，购自中科院上海细胞库。

1.2实验试剂澳洲胎牛血清：批号1431602，Gibco；DMEM高糖培养液：批号NYH0948，Gibco；青链霉素混合液(100X)：批号20140417，Solarbio；0.25%胰蛋白酶：(1：250，25 g)，批号20140216，Gibco；PBS磷酸盐缓冲液：0.01 mol·L-1，PH 7.2～7.4，批号509E024，Solarbio；MTT：批号1028D005，Solarbio；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、SOD试剂盒、MDA试剂盒：批 号分 别为20140416、20140332、20140423，上海基免实业有限公司。

2　实验方法与结果

2.1茅苍术提取物的制备茅苍术药材采自江苏茅山，阴干备用。准确称取粉碎过筛的茅苍术，以重蒸水提前浸泡1 h，加水回流提取1 h，纱布过滤，药渣继续提取1 h，合并两次的滤液并浓缩成浸膏状，于65℃烘干，得茅苍术提取物(每克相当于生药约3.5 g)。称取以上项已制备好的茅苍术提取物约0.2 g，精密称定，置于小烧杯中，缓慢加入95%乙醇，慢加快搅，至不再有絮状物析出为止。

2.2分析方法

2.2.1溶液配制PBS缓冲液(PH=7.2)的配制：将一包PBS粉 末溶 于2 L的三 蒸 水里，溶 解，121℃灭30 min，备用。DMEM双抗培养液：DMEM 500 mL +双 抗5.5 mL，4℃存放。10%胎牛血清的DMEM培养液：胎牛血清10 mL+ DMEM 90 mL，混匀，4℃存放。

2.2.2实验分组将96孔板中已经培育24 h的H9c2细胞更换新的培养液，根据预实验的情况，分组处理：①正常对照组：用培养液正常培养；②H2O2损伤组：加入H2O2使其终浓度为100 μmol·L-1，作用细胞2 h；③阳性Vc组：注入Vc液使其最后浓度是500 μg·mL-1；④空白。血清组：培养液中加入空白血清；⑤含药血清组：培养液中加入含药血清；⑥高剂量茅苍术水提液作用组：加入2.1项下茅苍术水煎液使其最后浓度为 500μg·mL-1；⑦中剂量茅苍术水提液作用组：加入茅苍术水提液使其终浓度为250 μg·mL-1；⑧低剂量茅苍术水提液作用组：加入茅苍术水提液使其终浓度为100 μg·mL-1。各处理组均为先加入 H2O2损伤2 h，再加入药物作用24 h。观察细胞的形态，并收集各组培养液，检测LDH释放量，SOD活力，MDA含量及细胞活力。

2.2.3观测指标

2.2.3.1细胞形态学观测

2.2.3.2乳酸脱氢酶(LDH)活力测定分别收集每个实验组的上层培养液，采用试剂盒说明书的方法测 定，血 清中LDH的活性以U·L-1表示。

乳酸脱氢酶(LDH)丙酮酸

(公式1)

将测得的值带入以下公式，求出LDH的活性值。

LDH 的活性(U·L-1)=(A测定值-A对照值)/(A标准值-A空白值)×标准品浓度(2 mmol·L-1)× 测试前样本稀释倍数× 1000

(公式2)

2.2.3.3MDA含量检测分别收集各实验组的细胞培养液，采用试剂盒说明书的方法测定。

MDA含量(nmol·mL-1)=(A测定值-A对照值)/(A标准值-A空白值)× 标准品浓度(10 nmol·mL-1) × 样本稀释倍数

(公式3)

2.2.3.4SOD 活力检测分别收集各实验组的细胞培养液，采用试剂盒说明书的方法测定。

SOD活力(U·mL-1)=(A对照值-A测定值)/A对照值÷50%×反应体系的稀释倍数×样本测试前的稀释倍数

(公式4)

2.2.3.5细胞相对凋亡情况的检测采用MTT比色法，用PBS配制MTT，浓度为5 mg·mL-1，在对细胞完成各种干预实验后，每孔加入MTT 20 μL，连续培育4 h，最后停止；轻轻的吸走孔里的上清，分别加DMSO液150 μL，振摇10 min，彻底溶解甲瓒；在酶标仪的490 nm波长下，检测每孔的A值，将各组所测得的吸光度值带入细胞活力计算公式，求出各实验组的细胞活力[149]。

细胞活力(%)=A实验/A参照×100%

(公式5)

2.3实验结果

2.3.1对细胞形态的影响用不同的药物处理完细胞之后，将其放在倒置显微镜下观测：未处理组的细胞继续生长，成梭形或者无规则形状，核是扁圆形或者紧贴细胞壁；H2O2损伤组和空白血清组细胞均体积变小，为圆形或者椭圆，细胞核浓缩，细胞边缘模糊，部分发生溶解；阳性Vc作用组细胞与H2O2损伤组的相比，贴壁细胞数量较多，生长状态较好；相对于损伤组而言，不同浓度的茅苍术水煎液作用组贴壁细胞数量较多，且外部形态明显好转，说明其生长状态得到了改善；不同剂量茅苍术水提液作用组细胞的生长状态不同，高剂量组细胞的生长较好，中剂量组的次之，低剂量组的较差。

2.3.2茅苍术及其含药血清对心肌细胞MDA含量、SOD活力及LDH释放量的影响LDH释放量、SOD的活力测定结果及MDA含量的变化情况见表1，H2O2损伤组细胞的LDH释放量和MDA含量明显增高，分别是正常对照组的1.38倍、4.31倍，SOD活性显明下降，为未处理组的34%；而高、中、低剂量茅苍术水提液作用组的LDH释放量和MDA含量都有所降低，LDH释放量与H2O2损伤组相比分别降低了16.01%、14.80%、8.14%，MDA与H2O2损伤组相比分别降低了28.52%、60.70%、56.36%；高、中、低剂量茅苍术水提液作用组的SOD活力都有所升高，SOD与H2O2损伤组相比分别升高了60.27%、48.55%、6.96%；而阳性Vc对照组LDH释放量和MDA含量明显低于损伤组，高于茅苍术水提液作用组，SOD活力也是明显比损伤组高。

2.3.3细胞相对凋亡情况每个处理组细胞的相对凋亡率如图1，以未处理组的相对存活率为标准，H2O2模型组的损伤率很明显的升高，为44.34%；茅苍术水提液保护组细胞的存活率与茅苍术水提液成浓度剂量关系，即细胞的相对存活率随着茅苍术水提液的浓度升高而明显增大，分别为72.37%、66.19%、55.44%，低剂量组的茅苍术水提液对H2O2损伤的H9c2心肌细胞的保护作用不明显；跟空白参照组比对，含药血清组细胞的生活率也较高，为67.08%；与H2O2模型组比较，正常对照组、阳性Vc组和茅苍术水提液高浓度组成极显著性差异，含药血清组和茅苍术水提液中剂量组成显著性差异，其余组差异性不明显。

组别LDH/U·L-1MDA/nmol·mL-1SOD/U·mL-1正常对照组280.63±9.069.14±0.1046.54±0.18H2O2模型组388.09±8.111)3)39.44±0.082)4)15.64±0.182)4)阳性Vc对照组307.29±5.856)13.73±0.116)41.45±0.196)空白血清组350.37±5.931)36.54±0.151)3)29.75±0.491)3)含药血清组327.11±4.535)23.26±0.145)36.69±0.255)水提液高剂量组325.97±8.225)28.19±0.161)3)39.36±0.136)水提液中剂量组330.65±7.305)15.50±0.151)6)30.40±0.211)3)水提液低剂量组356.51±10.471)17.21±0.161)6)16.81±0.852)4)

注：与正常对照组比较，1)P<0.05，2)P<0.01；与阳性Vc组比较，3)P<0.05，4)P<0.01；与模型组比较，5)P<0.05，6)P<0.01

图1　不同处理组细胞的存活率(与H2O2损伤组比对，*P<0.05，**P<0.01)

3　讨论

本研究利用H9c2细胞株建立H2O2损伤模型，从细胞形态、乳酸脱氢酶、抗氧化以及细胞凋亡等方面探讨茅苍术水提液的保护作用，结果显示，H2O2的损伤作用能使H9c2细胞皱缩变圆、数目减少；细胞膜的透过性变大，导致心肌酶向胞外漏出，培养液中LDH的量明显变大；同时发生的脂质过氧化作用产生了大量自由基，培养液中SOD活力降低，MDA含量增大。本实验以Vc作为保护心肌细胞的阳性对照药物，旨在对比观察不同剂量茅苍术水提液的保护作用。这部分的研究显示，Vc对被损坏的心肌细胞显现出很好的保护效果，但本试验中的Vc浓度尚不能完全阻断H2O2对心肌细胞的损伤作用。而3种剂量茅苍术水提液预处理，均能不同程度的改善细胞形态，提高细胞存活率，降低H2O2诱导的LDH的释放量、提高SOD活力、减少MDA含量以及细胞的凋亡率；并且呈现剂量依赖关系，低剂量茅苍术水提液可使脂质过氧化物的产生与积累减少，中剂量茅苍术水提液进而提高自由基清除能力，尤其对MDA的含量有明显的降低作用，高剂量茅苍术水提液同时具有增强抗氧化酶活性的作用。提示茅苍术水提液的保护作用机制与增强细胞抗氧化能力、减少自由基和脂质过氧化物导致的细胞膜损伤有关。

本研究建立的细胞模型比较可靠、简单，可用于心肌细胞的损伤机制和抗氧化的药效机理方面的研究；同时也初步证实了茅苍术水提液及其含药血清对H2O2所致心肌细胞的损伤具有保护作用，推测茅苍术含药血清中的入血成分可能是其发挥抗氧化作用的重要物质之一，提示茅苍术含药血清中的入血成分可能是其药效物质。

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doi:10.3969/j.issn.1003-8914.2016.09.021

文章编号：1003-8914(2016)-09-1248-03

收稿日期：(本文校对：刘言言2015-09-17)

Protective Effect of Atractylodes lancea on Oxidative Injury of H9c2 Myocardial Cells

YANG JiayongLIU Bili

(Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Xiamen University, Fujian, Xiamen 361003, China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the protective activity of Atractylodes lancea decoction and its medicated serum on H9c2 cell. MethodsThe H2O2-based oxidative injury model was established by cultivating rat cardiomyocytes of H9c2 in vitro, and the antioxidant activity was evaluated by cell morphology, apoptosis and the effect on SOD. ResultsThe growth state of the cells could be improved by the decoction of the different concentrations of Atractylodes lancea, and the external form was significantly improved. The high dose group cells grew well, and the low dose group was poor. The release amount of LDH and MDA of Atractylodes lancea group were significantly lower than those of the Vc control group, SOD activity was significantly higher than that in the injury group, the relative survival rate of cells with the concentration of aqueous extract of Atractylodes lancea obviously increased, it was 72.37%, 66.19% and 55.44%, respectively. The protective effect of the aqueous extract of the low dose group on the H2O2 damage of H9c2 myocardial cells was not significant. ConclusionThe mechanism of protective effect of water extract of Atractylodes lancea liquid is related to enhancing cellular antioxidant capacity and cell membrane damage caused by reducing free radicals and lipid peroxide.

Key words：Atractylodes lancea; H9c2 myocardial cells; Protective effect