茶树花蛋白质碱提和酶提工艺优化及其功能性质

侯玲， 沈娴， 陈琳， 金恩惠， 吴媛媛， 屠幼英

(浙江大学农业与生物技术学院茶学系,中国国际茶树花研究中心，杭州 310058)



茶树花蛋白质碱提和酶提工艺优化及其功能性质

侯玲， 沈娴， 陈琳， 金恩惠， 吴媛媛*， 屠幼英*

(浙江大学农业与生物技术学院茶学系,中国国际茶树花研究中心，杭州 310058)

采用Osboren蛋白质分类法对茶树花蛋白质进行分类，通过正交试验研究茶树花蛋白质碱法和酶法提取的最佳工艺，并对用这2种方法所提蛋白质的功能特性进行比较研究。结果表明：茶树花蛋白质组成以清蛋白为主，适合用碱法提取。碱提法最佳组合为NaOH浓度0.15 mol/L，提取时间2.5 h，提取温度75 ℃，液固比30∶1，在此条件下的蛋白质提取率达到91.45%，蛋白质纯度达到90%。酶法提取工艺的最佳条件为碱性蛋白酶添加量5%，液固比50∶1，提取时间2 h，提取温度60 ℃，提取率为79.12%，蛋白质纯度为55%。碱法提取的茶树花蛋白质纯度、持水性、乳化稳定性和起泡性优于酶法提取，而酶法提取的茶树花蛋白质的乳化性、吸油性、泡沫稳定性、溶解性优于碱法提取。此外，茶树花碱提和酶提蛋白质对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl，DPPH)自由基的清除率分别达到50.79%和56.04%，具有一定的抗氧化功能。

茶树花蛋白质； 碱法提取； 酶法提取； 功能性质

Summary Tea flower is a new food resource with high protein and low fat, but there are few reports on the total protein extraction of tea flower so far.

In this work, the tea flower protein was classified by Osboren method, and alkaline and enzymatic extractions were used for obtaining the total protein of the tea flower, and the functional properties of the protein were further analyzed. The single factor design of alkaline extraction was four levels of NaOH concentration (0.01, 0.05, 0.10 and 0.30 mol/L), five levels of time (0.5, 1.0, 2.0, 3.0 and 4.0 h), four levels of temperature (40, 60, 80 and 90 ℃) and five levels of liquid-solid ratio (8∶1, 15∶1, 20∶1, 30∶1 and 60∶1). Screening test result showed that the alkaline protease was the most suitable enzyme for enzymatic extraction, and the single factor design of enzymatic extraction was four levels of the amount of alkaline protease (0.1%, 1.0%, 4.0% and 8.0%), four levels of liquid-solid ratio (10∶1, 20∶1, 30∶1 and 40∶1), four levels of time (0.5, 1.0, 2.0 and 3.0 h) and three levels of temperature (30, 50 and 70 ℃).

The results of Osboren experiment showed that the tea flower proteins were mainly composed of albumin, accounting for 53.86%, which was suitable for alkaline extraction. Based on the results of single factor test and orthogonal array design, the optimal conditions of alkaline extraction were 0.15 mol/L NaOH, 2.5 h, 75 ℃ and liquid-solid ratio of 30∶1, and the highest protein extraction rate and purity were 91.45% and 90%, respectively. The optimal condition of enzymatic extraction were 5% alkaline protease, liquid-solid ratio of 50∶1, 2 h and 60 ℃, and the highest protein extraction rate and purity were 79.12% and 55%, respectively.

The functional properties of the tea flower protein from alkaline and enzymatic extractions were different. The purity, water retention capacity, emulsion stability and foamability from alkaline extraction were 90%, 4.00 mL/g, 85.18% and 100.00%, which were higher than those (55%, 3.60 mL/g, 30.76% and 80.00%) of enzymatic extraction. The emulsibility, oil absorption capacity, foam stability and solubility of the tea flower protein from enzymatic extraction were 83.87%, 4.40 mL/g, 72.92% and 89.00%, which were higher than those (77.14%, 4.00 mL/g, 40.00% and 60.60%) of alkaline extraction. Besides, the protein from alkaline and enzymatic extractions had good abilities on scavenging 1,1-dipheny-2-picryhydrazyl (DPPH) free radical with the rate of 50.79% and 56.04% respectively, suggesting anti-oxidative function of the tea flower protein.

In sum, the present work provides optimization methods on the extraction of tea flower protein. The good functional properties with water retention capacity, oil absorption capacity, emulsibility, foamability and anti-oxidative ability and so on of the protein will expand the application of tea flower in the field of food and cosmetics.

茶树花作为茶树[Camelliasinensis(L.) O. Kuntze]的主要生殖器官之一，具有“花期长、开花量大”的特点[1]。有研究显示，成龄茶园鲜花可采收量达200～300 kg/667 m2[2]；2014年的统计数据显示，全国茶园面积274 hm2，按60%茶园采摘茶树花计，全国茶区可产茶花600多万t/a。随着茶园面积的扩大，茶树花的可采数量不断增加，是一种相当丰富的资源。

苏松坤等[3]比较全面地测定了茶花粉中的多种营养成分，结果表明，茶树花所含成分种类与茶叶基本相同，如茶多糖和茶蛋白等，对人体具有解毒、抑菌、防癌抗癌和增强免疫力等功效。伍锡岳等[4]在进行茶树花茶的研制中发现茶树花具有“高蛋白、低脂肪”的特点。关于茶叶蛋白质的研究显示，其蛋白质不仅具有很好的营养品质，还具有较强的清除氧自由基的能力[5]；非水溶性茶蛋白质降脂效果明显，对于抗动脉粥样硬化及冠心病有一定预防作用[6]。茶树花作为一种蛋白质新资源，目前开发和利用得较少。本文采用工艺简单、成本较低的碱法和酶法提取茶树花蛋白质，研究碱法(NaOH)和酶法(碱性蛋白酶)提取茶树花蛋白质的工艺优化及茶树花蛋白质的功能特性，为建立绿色环保、低能耗的茶树花蛋白质制备方法提供理论和实践依据。

1　 材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验原料

茶树花干花，由浙江益龙芳茶业有限公司提供。

1.1.2主要试剂

中性蛋白酶、复合风味蛋白酶、碱性蛋白酶、纤维素酶(江苏锐阳生物科技有限公司)，氢氧化钠(NaOH)、盐酸(HCl)等化学试剂均为国产分析纯。

1.1.3主要仪器

UV7595紫外-可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；离心机(德国Eppendorf公司)；数显恒温水浴锅(江苏省常州市国华电器有限公司)；FE20精密pH计(上海瑞纺仪器有限公司)；JB90-S高速电动搅拌器(上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司)；CHRIST冷冻干燥机(北京奥创兴业科技发展有限公司)；KDN-2C型凯式定氮仪(上海纤检仪器有限公司)。

1.2试验方法

1.2.1茶树花水分、蛋白质总量及Osboren蛋白质分类与组成测定

茶树花干花水分参照GB/T 8304—2013茶水分测定；茶树花总蛋白质参照GB 5009.5—2010食品中蛋白质的测定(凯氏定氮法)。

Osboren蛋白质分类及各蛋白质组分含量测定：以茶树花(80目)为材料进行Osboren蛋白质分类提取，方法参见文献[7]，提取得到的茶树花清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白采用凯氏定氮法测定，并计算各种蛋白质的含量。

1.2.2茶树花蛋白质碱法提取流程及单因子试验设计

碱法提取：80目茶树花粉末→加碱溶液→控温碱提→冷却、离心→取上清液、测蛋白质→提取液脱色、酸沉→透析脱盐、冷冻干燥→功能性质评价。

按照提取流程，分别对碱法提取中NaOH浓度、提取时间、提取温度和液固比4个因子对蛋白质提取率的影响进行研究；单因子水平设计如表1所示。

1.2.3茶树花蛋白质酶法提取流程及单因子试验

酶法提取： 80目茶树花粉末→加酶→控温酶提→灭酶活→冷却、离心→取上清液、测蛋白质→提取液脱色、酸沉→透析脱盐、冷冻干燥→功能性质评价。

按照提取流程，分别对酶法提取中酶添加量、液固比、提取时间和提取温度4个因子对蛋白质提取率的影响进行研究；单因子水平设计如表2所示。

1.2.4茶树花蛋白质酶法提取的酶类筛选试验

用复合风味蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、纤维素酶4种酶按照1.2.3节中的酶法提取流程分别提取茶树花蛋白质，以蛋白质提取率为评价标准，筛选出具最佳提取率的酶用于单因子及正交试验。

1.2.5 碱法和酶法提取正交试验设计

对茶树花蛋白质碱提法和酶提法单因子试验进行显著性分析，根据单因子试验结果，设计4因子3水平L9(34)正交方案进行碱提和酶提条件优化；正交试验设计见表3和表4。

表3茶树花蛋白质碱法提取正交试验因子水平表

Table 3Factors and levels used in orthogonal array design of alkaline extraction of tea flower protein

水平Level因子FactorANaOH浓度NaOHconcentration/(mol/L)B提取时间Extractiontime/hC提取温度Extractiontemperature/℃D液固比Liquid-solidratio10.050.54510∶120.151.56020∶130.252.57530∶1

表4　茶树花蛋白质酶法提取正交试验因子水平表

1.2.6碱提和酶提蛋白质的功能特性评价方法

蛋白质溶解性、持水性、吸油性、乳化性及稳定性、起泡性及泡沫稳定性评价方法参见文献[8-10]。自由基清除能力测定采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl，DPPH)法[11]。

1.2.7茶树花蛋白质纯化方法

将碱法与酶法蛋白质浸提液进行脱色、透析、酸沉、冷冻干燥：将活性炭与浸提液混合进行脱色处理[12]，然后离心分离，将上层脱色液的pH调节为茶树花蛋白质的等电点，使蛋白质沉淀[13]，将沉淀物冷冻干燥，获得茶树花蛋白质提取物，并测定提取的蛋白质纯度。

1.2.8蛋白质提取率和纯度计算

蛋白质提取率/%=提取样品中蛋白质质量/原料中总蛋白质质量×100。

蛋白质纯度/%=提取样品中蛋白质质量/提取样品质量×100。

1.2.9数据统计分析

所有试验重复3次，数据结果以平均值±标准偏差表示，采用SAS 9.1软件进行统计分析。

2　结果与分析

2.1茶树花含水量、蛋白质总量及其组成

茶树花干花含水量为7.1%，在其适宜储存的含水率范围内。经凯氏定氮法测定得出，茶树花总蛋白质为14.94%。

采用Osboren蛋白质分类法测得茶树花蛋白质含有清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白4种；用凯氏定氮法测定表明，在茶树花蛋白质组分中含有大量的水溶性清蛋白，达53.86%(图1)，适于碱法提取。

2.2茶树花蛋白质碱法提取试验结果与分析

2.2.1单因子试验结果与分析

在碱提法中各因子对茶树花蛋白质提取率的影响见图2。由图2A可知，随着NaOH浓度的增大，茶树花蛋白质提取率逐渐提高。这是由于碱液能破坏蛋白质分子的次级键，使得某些极性基团解离，从而使蛋白质表面分子具相同电荷，增加了蛋白质分子溶解作用[14]。但当NaOH浓度大于0.10 mol/L之后，蛋白质提取率提高较慢。这是由于在过高的碱

图1　经Osboren分类的茶树花蛋白质组成及含量Fig.1　Composition and content of tea flower protein by Osboren classification

浓度下，加快了美拉德反应[15]，使可溶性蛋白质与还原糖发生反应，使蛋白质变性和水解。由图2B可知，提取温度由40 ℃上升到80 ℃左右时，提取率随温度上升而增大，但超过80 ℃后，提取率开始降低。这可能是由于温度上升使蛋白质构象发生改变，分子立体结构变得伸展，有利于蛋白质分子和水分子相互作用，使蛋白质的溶解性增大，提高了茶树花蛋白质的提取率[16]。当提取温度继续升高时，由于维持蛋白质空间构象的次级键被破坏，促进了蛋白质分子间相互结合而形成沉淀[17-19]，从而使提取率不再增加。

图2　碱法提取因子对茶树花蛋白质提取率的影响Fig.2　Effect of alkaline extraction factors on extraction yield of tea flower protein

由图2C可以看出，随提取时间的增加，蛋白质提取率升高。这是因为随着时间增长，提取液中的蛋白质逐渐增多；而根据水平间显著分析，2 h与4 h的提取率间没有显著差异，考虑到生产成本，在正交试验中设提取时间不超过4 h。图2D显示，在液固比为10∶1～15∶1时，蛋白质提取率增加较快。原因是随着液固比提高，体系的黏度降低，加快了传质过程[20]。但之后随着液固比的增大，蛋白质提取率增加较慢。这是由于茶树花颗粒与液体的接触已达到了饱和状态，继续增加液固比也不会提高蛋白质的溶出。因此，为了节约水和碱，应尽量减少液固比；且经SAS 9.1软件单因子显著性分析发现，除了提取时间外，各因子水平间均达显著或极显著水平。

2.2.2正交试验结果及分析

由表5可以看出：根据4个因子的极差R值大小可得出各个因子对茶树花蛋白质提取率的影响，从大到小依次为提取温度(C)、NaOH浓度(A)、提取时间(B)、液固比(D)；根据因子中各水平总和K值可以得出，最优的水平组合为A2B3C3D3，即NaOH浓度0.15 mol/L，提取时间2.5 h，提取温度75 ℃，液固比30∶1。在此条件下重复进行提取，平均提取率可达到91.45%。

2.3茶树花蛋白质酶法提取试验结果与分析

2.3.1酶类筛选试验结果

从图3中可以看出，在各种酶类适宜的反应条件下，碱性蛋白酶提取率最高，达到50%以上；因此，

表5　茶树花蛋白质碱法提取L9(34)正交试验设计及结果

K1,K2,K3分别为各水平的和；R：极差。

K1,K2,K3represent sum value of each level, respectively;R: Range.

图3　不同酶类对茶树花蛋白质提取率的影响Fig.3　Effect of different enzymes on extraction rate of tea flower protein

本文选取碱性蛋白酶用于酶法提取茶树花蛋白质试验。

2.3.2单因子试验结果与分析

酶法提取各因子对茶树花蛋白质提取率的影响见图4。由图4A可以看出，在碱性蛋白酶添加量较低时提取率随酶量的增加而提高。这是由于碱性蛋白酶为内切酶，可以使大的蛋白质分子降解为小分子而有利于茶树花蛋白质的溶出。而当加酶量继续增加时，提取率并未增加，反而有所降低。这可能是由于加酶量增加到一定程度时，对不溶性蛋白质的水解能力达到饱和。除此之外，由于加酶量提高，部分蛋白质会被水解为更小的肽，导致蛋白质提取总量降低[20]。

由图4B可见，随着液固比增大提取率增大而没有达到平衡。说明此单因子试验设计的最大液固比偏小，在正交试验设计中应适当增加最大液固比。从图4C可以看出，随着提取时间的增加，提取率并未有显著增加。说明提取时间对碱性蛋白酶酶解效率的影响较小，从生产成本及节约能源出发，提取时间可选择小于3 h。由图4D可知，温度对提取率的影响较为显著。随着温度的增加，提取率先增大后减小。表明碱性蛋白酶的最适温度为50 ℃左右，此时的提取率达最大。利用SAS 9.1软件的单因子显著性分析发现，除酶添加量外，各因子水平间均达显著或极显著水平。

2.3.3正交试验结果与分析

由表6可以看出：根据4个因子的极差R值可得出各个因子对茶树花蛋白质提取率的影响，从大到小依次为液固比(b)、提取时间(c)、提取温度(d)、酶添加量(a)；根据各水平总和K值可以得出，最优的水平组合为a3b3c2d3，即酶加量5%，液固比50∶1，提取时间2 h，提取温度60 ℃。并在此条件下重复试验，蛋白质的平均提取率可达79.12%。

图4　碱性蛋白酶提取因子对茶树花蛋白质提取率的影响Fig.4　Effect of alkaline protease extraction factors on extraction yield of tea flower protein

序号Numbera酶添加量Amountofenzyme/%b液固比Liquid-solidratioc提取时间Extractiontime/hd提取温度Extractiontemperature/℃蛋白质提取率Proteinextractionrate/%11(1)1(30∶1)1(1)1(40)54.81212(40∶1)2(2)2(50)70.01313(50∶1)3(3)3(60)78.5942(3)12366.805223171.956231262.2273(5)13263.178321372.959332178.20K1203.41184.78189.98204.97K2200.96214.92215.01195.40K3214.33219.01213.71218.34R13.3734.2325.0322.40

K1,K2,K3分别为各水平的和；R：极差。

K1,K2,K3represent sum value of each level, respectively;R: Range.

2.4碱法与酶法提取的茶树花蛋白质功能性质分析

从蛋白质纯化过程中得出，m(活性炭)/g∶V(浸提液)/mL=1∶15，温度60 ℃，时间1 h的脱色处理效果较好。在pH调节为2～3时茶树花蛋白质达到等电点，开始沉淀。测得碱提和酶提茶树花蛋白质的纯度分别为90%和55%。这可能是由于在酶解过程中大量大分子蛋白质被水解成了较小的多肽而使得最终的蛋白质纯度较低。

同时，对碱法和酶法提取茶树花蛋白质提取物的溶解性、持水性、吸油性、乳化性及稳定性、起泡性及泡沫稳定性、对DPPH自由基清除率等功能性质进行了比较，结果见表7。从中可知：酶提蛋白质的溶解度明显高于碱提蛋白质。这可能是由于碱性蛋白酶的水解作用使蛋白质结构改变，多肽链断裂，使其中的离子化羧基和氨基暴露出来，分子的极性增大，蛋白质之间亲水作用增强，酶提蛋白质的溶解性提高[9]。2种方法提取的茶树花蛋白质均具有良好的持水性及吸油性。对于乳化性，碱提和酶提蛋白质的效果相当，但乳化稳定性却表现出极大的差异，碱提茶树花蛋白质的乳化稳定性明显优于酶提蛋白质。就起泡性而言，碱提茶树花蛋白质明显优于酶提蛋白质，可能是由于酶提蛋白质被碱性蛋白酶过度水解，产生了较多小分子蛋白质多肽，从而降低了蛋白质的起泡性。蛋白质的发泡性能不仅与蛋白质分子表面基团的极性有关，同时也与蛋白质的分子大小有关，蛋白质的水解度大，不利于泡沫的形成。同时，碱提和酶提蛋白质对DPPH自由基的清除率分别达到了50.79%和56.04%，表现出一定的抗氧化活性，且2种蛋白质的抗氧化性相当。

表7茶树花碱提和酶提蛋白质的功能性质对比

Table 7Comparison of protein function by alkaline and enzymatic extractions

功能性质 Functionalproperties碱法提取 Alkalineextraction酶法提取 Enzymaticextraction溶解度Solubility/%60.6089.00持水性Waterretentioncapacity/(mL/g)4.003.60吸油性Oilabsorptioncapacity/(mL/g)4.004.40乳化性Emulsibility/%77.1483.87乳化稳定性Emulsionstability/%85.1830.76起泡性Foamability/%100.0080.00泡沫稳定性Foamstability/%40.0072.92DPPH清除率ScavengingrateofDPPHfreeradical/%50.7956.04

3　讨论

茶树花是2013年公布的食品新资源之一，是一种附加值很高的天然植物资源。本研究采用Osboren蛋白质分类法将茶树花蛋白质分类，测定结果表明，茶树花蛋白质适合用碱法提取。在茶树花蛋白质中部分醇溶蛋白质直接用水难以提取，我们在碱法提取的同时也研究了酶法提取对蛋白质提取率的影响，并通过正交试验优化了酶法提取方案；同时，对比分析了碱法和酶法提取的茶树花蛋白质的理化及其功能性质。植物蛋白质作为常用的食品基料，具有持水性、吸油性、乳化性、起泡性、抗氧化性[8]等重要的功能性质。在本研究中,碱法和酶法提取的蛋白质均具有上述良好的功能性质。

该研究结果为茶树花的深度开发及其在食品和日化等领域的进一步应用提供了理论和实践依据。

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HOU Ling, SHEN Xian, CHEN Lin, KIM Eunhye, WU Yuanyuan*, TU Youying*

(InternationalTeaFlowerResearchCenter,DepartmentofTeaSciences,CollegeofAgricultureandBiotechnology,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China)

tea flower protein; alkaline extraction; enzymatic extraction; functional property

浙江省重大科技专项(2013C02024-4)；浙江省茶产业科技创新团队项目(2011R50024)；浙江省自然科学基金(LY16C200004).

Corresponding authors)：吴媛媛(http://orcid.org/0000-0001-8022-6736),E-mail:yywu@zju.edu.cn；屠幼英(http://orcid.org/0000-0002-9539-1678)，E-mail:youytu@zju.edu.cn

联系方式：侯玲(http://orcid.org/0000-0001-8466-7838)，E-mail:littleh@zju.edu.cn

2015-08-05；接受日期(Accepted)：2015-10-10；网络出版日期(Published online)：2016-07-19

TS 201.1; TS 272

A

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/33.1247.S.20160719.1838.006.html