Caspase-3在皮肤鳞状细胞癌及光线性角化病中的表达

施 健张克进缪 旭林 桦刘宏斌杨 扬



·论著·

Caspase-3在皮肤鳞状细胞癌及光线性角化病中的表达

施 健1张克进2缪 旭1林 桦1刘宏斌3杨 扬1

目的： 检测Caspase-3在皮肤鳞状细胞癌及光线性角化病组织中的表达。方法： 应用免疫组化法检测16例皮肤鳞状细胞癌皮损、27例光线性角化病皮损及24例正常皮肤组织中Caspase-3蛋白的表达。结果： Caspase-3在皮肤鳞状细胞癌、光线性角化病及正常皮肤组织的表达率分别为37.50%，51.85%，79.17%，其表达含量在皮肤鳞状细胞癌、光线性角化病、正常皮肤组织逐渐增加。结论： Caspase-3蛋白表达下调可能参与皮肤鳞状细胞癌及光线性角化病的发病过程。

Caspase-3； 皮肤鳞状细胞癌； 光线性角化病

光线性角化病（AK）又称日光性角化病，是因长期紫外线照射而发生的一种癌前期病变［1］。目前一种新的定义认为AK是一种皮肤原位癌，国外有报道指出未予治疗的AK可发展为侵袭性皮肤鳞状细胞癌（SCC），但演变过程的原因和机制尚不明确。有研究表明凋亡在肿瘤的发生、发展中扮演着重要的角色，Caspase-3是细胞凋亡通路中重要的执行者，其表达异常可引起细胞凋亡和增殖异常，进而导致肿瘤等多种疾病的发生［2］。但目前有关Caspase-3在皮肤SCC及AK发生发展中的报道较少见。笔者通过检测Caspase-3蛋白在皮肤SCC及AK中的表达情况，为进一步探讨凋亡蛋白Caspase-3在AK及皮肤SCC发病过程中所起的作用提供可能的理论参考。

1　材料与方法

1.1材料 石蜡包埋组织标本来自南通市第一人民医院皮肤科2005年1月至2013年12月经皮肤病理确诊的患者。SCC 16例，年龄（75.13±8.22）岁，其中男7例，女9例；病程3个月～6年；皮损部位：头面部14例，躯干1例，四肢1例。AK 27例，年龄（70.04± 11.43）岁，其中男9例，女18例；病程6个月～11年；皮损部位：头面部25例，躯干1例，四肢1例。正常对照组织24块取自2014年我科皮肤外科手术中修整遗弃后的正常组织，年龄（66.71±15.45）岁，其中男12例，女12例；取材部位：头面部15例，躯干3例，四肢6例。三组在年龄、性别及部位之间均具有可比性（P＞0.05）。

1.2主要试剂 Caspase-3兔抗人多克隆抗体购自Santa Cruz公司，稀释工作浓度为1∶80，Envision法检测试剂盒及DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物公司。

1.3实验方法 将标本于4%甲醛中固定，石蜡包埋，采用LAB VISION 2D全自动免疫组化染色仪、ELIVISION二步法进行免疫组化染色。操作要点如下：所需蜡块切成厚度为4 μm的薄片，载玻片要防止脱片：经洗涤剂浸泡8～24 h，流水冲洗过夜，蒸馏水漂洗2次，浸泡于95%酒精中过夜，蒸馏水洗2次，将载玻片排列整齐烘干，经POLY-L防脱片处理。置于67℃烘箱当中烘片2 h，脱蜡脱水。PBS冲洗，抗原修复用柠檬酸盐缓冲液，微波炉中火处理10 min，流水自然冷却。处理完毕后放入自动免疫组化染色仪中，编程。每张切片加1滴3%的H2O2，室温下孵育10 min，PBS冲洗；除去PBS液，每张切片加1滴一抗，在室温条件下孵育1 h，PBS冲洗；除去PBS，每张切片加1滴聚合物增强剂，室温下孵育20 min，PBS冲洗；除去PBS，每张切片加1滴抗鼠/兔聚合物，室温下孵育30 min，PBS冲洗；除去PBS液，每张切片加一滴新鲜配制的DAB，室温条件下显色5 min，蒸馏水冲洗。此过程均在自动免疫组化染色仪当中按照事先编好的程序完成。从自动免疫组化染色仪中取出已染色完毕的切片，苏木素复染，0.1%HCL分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。用已知阳性标本做阳性对照，用PBS代替一抗和二抗作为空白对照。

1.4结果判断 组织学上按照Eneroth等对高分化和低分化鳞癌的形态学描述进行分类。Caspase-3阳性判断标准以胞浆或胞核出现棕黄染色为阳性，显微镜下随机检测5个独立高倍镜视野，根据阳性细胞所占百分比进行，以平均每100个细胞中阳性细胞占观察细胞的百分比计算阳性细胞率，再取平均值。Caspase-3阳性标准：阳性反应的强度分为-（≤10%），+（10%～30%），2+（30%～51%），3+（＞51%）。1.5 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行卡方检验，检验水准α=0.05，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1Caspase-3阳性表达主要在细胞质及细胞核，其在皮肤SCC、AK及正常皮肤的表皮组织中表达含量逐渐增加（图1、2、3及表1）。16例皮肤SCC组织中6例表达阳性，阳性率为37.50%，其中14例高分化皮肤SCC中6例表达阳性，2例低分化皮肤SCC均表达阴性。27例 AK组织中14例表达阳性，阳性率为51.85%。24例正常对照组中19例表达阳性，阳性率为79.17%。正常对照组Caspase-3的表达高于AK组及SCC组，三组间表达具有统计学差异（χ2=7.60，P＜0.05）。

图1　皮肤鳞状细胞癌皮损中Caspase-3的表达（SP，×100）

图2　光线性角化病皮损中Caspase-3的表达（SP，×100）

图3　正常皮肤组织中Caspase-3的表达（SP，×100）

表1　Caspase-3蛋白在SCC、AK及正常皮肤中的表达 例

2.2Caspase-3在皮肤SCC组织中的表达低于正常对照组（χ2=7.11，P＜0.01），在AK组织中的表达亦低于正常对照组（χ2=4.15，P＜0.05），Caspase-3在皮肤SCC组织中的表达与AK组相比，无统计学差异（χ2= 0.83，P＞0.05）。

2.3Caspase-3在皮肤SCC组织，尤其是异型细胞数量多的区域表达多呈阴性（10/16），在AK组织中表达仍以阴性（13/27）为主，少许中度阳性（6/27）及强阳性（5/27），而在正常对照组中，Caspase-3在表皮组织广泛强阳性表达（11/24）。

3　讨论

目前越来越多的学者认为AK是一种皮肤原位癌，其实一开始就是从表皮棘细胞开始的鳞状细胞癌，其作为一个多步衍生肿瘤的早期阶段，以生物学统一体为特征，进一步扩散成鳞状细胞癌［3-5］。国外有报道指出未治疗的AK可发展为SCC。虽然每年仅约0.25%～20%的AK病变发展为SCC，然而60% 的SCC来源于AK［6］。

凋亡是在生命进化过程中形成的保守的基本生命活动之一，它能清除机体损伤、衰老或多余的细胞，是维持机体发育和自身组织稳定的重要生命现象。细胞凋亡的改变可以引起肿瘤的发生、发展。在细胞凋亡的信号传递中，Caspase家族居于重要地位。现认为Caspase-3的激活是凋亡的最终通路［7］。Eckhart等［8］研究显示，从Caspase-1～10，除Caspase-5外，其余 Caspases均在人类角质形成细胞中表达。Lippens等［9］研究发现正常表皮中表达的Caspase-3无活性，而肿瘤组织中表达的Caspase-3有活性，提示Caspase-3与肿瘤细胞的凋亡有关。本研究中正常表皮组织中可见Caspase-3蛋白的广泛性高表达，阳性率达79.17%，明显高于在AK组织表达阳性率（51.85%）及皮肤SCC组织表达阳性率（37.50%），且发现Caspase-3蛋白在皮肤SCC、AK及正常对照组织中的表达成逐渐增多的趋势，三组间表达具有统计学差异（χ2=7.60，P＜0.05）。从正常组织到AK，最后到皮肤SCC，Caspase-3蛋白阳性表达率逐渐降低，提示Caspase-3作为促凋亡因子，其表达的下降，可能导致AK及皮肤SCC的发生。促凋亡因子的低表达，抑制了细胞的凋亡过程，促进了肿瘤细胞的增殖，此现象与通常的细胞凋亡理论相吻合。通常情况下，促凋亡因子的高表达可促进凋亡的发生，引起肿瘤细胞死亡，从而抑制肿瘤的发展。我们的研究结果与邢君、陶菲克等［10，11］的文献报道一致。本研究中Caspase-3在皮肤SCC组织中的表达与AK组相比，无统计学差异（χ2=0.83，P＞0.05），考虑与本研究中低分化皮肤 SCC组织标本过少有关，从而推测Caspase-3表达含量可能与异型细胞数量有关，异型细胞数量越多，分化程度越低，其表达含量越少。

我们的实验结果显示Caspase-3蛋白表达与皮肤表皮肿瘤发生发展有关，恶性程度越高，其表达含量越低。对Caspase-3蛋白的检测可能有助于早期发现表皮肿瘤，尤其是皮肤SCC及AK，我们期望找到针对Caspase-3的靶位点进行干预治疗，进而逆转或者延缓肿瘤过程。然而，由于实验时间和条件的限制，我们尚未能找到相关的能够阻断该细胞调亡途径的靶向治疗药物，期待以后的进一步深入研究。此外，本实验仅采用免疫组化方法从蛋白水平研究Caspase-3在皮肤肿瘤中的表达，期待今后从DNA和RNA水平对其及相关因子进行更深入的研究。

［1］孙建方，高天文.皮肤组织病理学［M］.北京：人民卫生出版社，2013.185-186.

［2］Boland K，Flanagan L，Prehn JH.Paracrine control of tissue regeneration and cell proliferation by Caspase-3［J］.Cell Death Dis，2013，4：725.

［3］Heaphy MR Jr，Ackerman AB.The nature of solar keratosis：a critical review in historical perspective［J］.J Am Acad Dermatol，2000，43（1 Pt 1）：138-150.

［4］Ackerman AB，Mones JM.Solar（actinic）keratosis is a squamous cell carcinoma［J］.Br J Dermatol，2006，155（1）：9-22.

［4］Marks R.Who benefits from calling a solar keratosis a squamous cell carcinoma［J］.Br J Dermatol，2006，155（1）：23-26.

［6］Roewert-Huber J，Stockfleth E，Kerl H.Pathology and pathobiology of actinic（solar）keratosis-an update［J］.Br J Dermatol，2007，157：18-20.

［7］丁瑜洁，陈晓栋，顾黎雄.角化棘皮瘤和皮肤鳞状细胞癌凋亡相关蛋白表达的研究［J］.中华皮肤科杂志，2012，45 （2）：91-94.

［8］Eckhart L，Ban J，Fischer H，et al.Caspase-14：analysis of gene structure and mRNA expression during keratinocyte differentiation［J］.Biochem Biophys Res Commun，2000，277 （3）：655-659.

［9］Lippens S，Kockx M，Knaapen M，et al.Epidermal differentiation does not involve the proapoptotic executioner caspases，but is associated with Caspase-14 induction and processing［J］.Cell Death Differ，2000，7（12）：1218-1224.

［10］邢君，张宝林.Livin在皮肤鳞状细胞癌中的表达及其与FHIT、Caspase-3相关性的初步研究.肿瘤研究与临床，2009，21（5）：311-316.

［11］陶菲克，涂亚庭.Livin和Caspase-3在皮肤基底细胞癌和皮肤鳞状细胞癌组织中的表达及相关性分析.中国皮肤性病学杂志，2009，23（2）：87-88.

（收稿：2016-01-08 修回：2016-02-29）

Expression of Caspase-3 in cutaneous squamous cell carcinoma and actinic keratosis

SHI Jian1，ZHANG Kejin2，MIAO Xu1，LIN Hua1，LIU Hongbin3，YANG Yang1.
1.Department of Dermatology，First People's Hospital of Nantong，Nantong 226001，Jiangsu，China；2.Department of Dermatology，People's Hospital of Liaocheng，Liaocheng 252000，Shandong，China；3.Department of Pathology，First People's Hospital of Nantong，Nantong 226001，Jiangsu，China Corresponding author：SHI Jian，E-mail：jsntmcsj@163.com

Objective：To detect the level of Caspase-3 in the lesions of cutaneous squamous cell carcinoma and actinic keratosis.Methods：The level of Caspase-3 in 16 lesions of cutaneous squamous cell carcinoma，27 lesions of actinic keratosis and 24 normal skin was detected by immunohistochemistry method.Results：The positivity rate of Caspase-3 in the lesions of cutaneous squamous cell carcinoma，actinic keratosis and normal skin tissues was 37.50%，51.85%and 79.17%respectively.The expression quantity of Caspase-3 in the lesions of cutaneous squamous cell carcinoma，actinic keratosis and normal skin was increased gradually.Conclusion：The down-regulated expression of Caspase-3 may be involved in the pathogenesis of cutaneous squamous cell carcinoma and actinic keratosis.

Caspase-3；cutaneous squamous cell carcinoma；actinic keratosis

施健，E-mail：jsntmcsj@163.com

南通市卫生局青年科研基金项目（编号：WQ 2014003）

1南通市第一人民医院皮肤科，江苏南通，226001

2山东省聊城市人民医院皮肤科，山东聊城，252000

3南通市第一人民医院病理科，江苏南通，226001