肾上腺素β2受体对失血性休克大鼠骨骼肌PGC-1表达的影响

张　成，　高广荣，　李　达，　单永琪，　张雪峰

沈阳军区总医院 麻醉科，辽宁 沈阳　110016



·论著·

肾上腺素β2受体对失血性休克大鼠骨骼肌PGC-1表达的影响

张成，高广荣，李达，单永琪，张雪峰

沈阳军区总医院 麻醉科，辽宁 沈阳110016

摘要：目的探讨肾上腺素β2受体(AR-β2)对失血性休克(HS)大鼠骨骼肌过氧化物酶体增殖物激活受体γ协同刺激因子(PGC-1)表达的影响。方法将62只SD大鼠随机分为对照组(n=6)、实验组(n=28)和干预组(n=28)。按22.5 ml/kg放血建立HS模型。干预组放血后，立即给予ICI 118.551以0.5 mg/kg静脉注射；休克30 min后，回输放出的血和2倍放血量的林格氏液；复苏期维持30 min，监测血流动力学8 h。记录建模前及建模后不同时点的红细胞比容(Hct)、乳酸、剩余碱和血糖。采用蛋白印迹法及定量聚合酶链反应(PCR)检测不同时间骨骼肌组织PGC-1蛋白及mRNA表达的变化。结果休克模型建立后，血乳酸升高、剩余碱减少。与实验组比较，干预组可以显著降低血乳酸并增加碱剩余。休克组动物的死亡率明显高于干预组。虽然复苏后2 h，实验组、干预组均出现PGC-1蛋白和mRNA的表达增加，但实验组增加更为显著，差异有统计学意义(P<0.05)；其后，两组PGC-1蛋白和mRNA的表达均逐渐下降，两组差异无统计学意义(P>0.05)。结论HS时，AR-β2可对PGC-1基因表达进行适应性调节，进而调控能量代谢平衡。

关键词：失血性休克；肾上腺素β2受体；过氧化物酶体增殖物激活受体γ协同刺激因子

DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2016.04.09

血清乳酸水平不但可以反映失血性休克(hemorrhagic shock，HS)中内环境代谢紊乱程度，还是判断预后的重要指标[1-2]。近年来研究发现，除了组织低灌注外，HS状态下产生的高儿茶酚胺血症可通过激活肾上腺素β2受体(β2-adrenergic receptor，AR-β2)-Na+-K+-ATP酶通路增加乳酸的产生[3-4]。AR-β2不但可以调节乳酸的生成，还能对寒冷、运动等应激状态下骨骼肌内能量代谢调节基因的过氧化物酶体增殖物激活受体γ协同刺激因子(peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator-1，PGC-1)的表达进行调控[5-6]。本研究旨在探讨AR-β2对HS大鼠的预后和骨骼肌内PGC-1表达的影响。现报道如下。

1　材料与方法

1.1实验材料成年SD大鼠(第三军医大学动物实验中心)。Datex-Ohmeda S/5多功能监护仪(芬兰德恩公司)；压力传感器(新加坡Biosensors 公司)；聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增仪(德国Biometra公司)；PE-50管(美国Sigma公司)；紫外分光光度计(英国UV-visible Spectrometer公司)；高速冷冻离心机(美国Sigma公司)；微量输液泵(WZ-50cz，浙大医学器械有限公司)；血气分析仪(Bayer Rapidlab 865型，德国Bayer公司)。RNA固定液(北京天恩泽基因科技有限公司)；荧光定量PCR试剂盒(大连宝生物工程大连有限公司)；肝素钠(天津生物化学制药有限公司)。PGC-1引物合成(北京华大基因公司)。PGC-1抗体(sc-13067，美国SANTA CRUZ公司)。

1.2动物准备SD大鼠(体质量300～350 g)雌雄不限，实验前12 h禁食，自由饮水。戊巴比妥那60 mg/kg腹腔内注射麻醉成功后，进行气管内插管和小动物呼吸机辅助呼吸，潮气量设定为7～8 ml/kg，呼吸频率设定为80 次/min，吸入氧浓度为40%。分离左侧股动脉及股静脉后插管，分别用于放血和复苏时液体回输，右侧颈动脉插管，用于监测平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)。麻醉及置管结束后，待大鼠自然苏醒，彻底清醒后稳定2 h再开始建立失血性休克模型。

1.3HS复苏模型建立采用定容性HS模型，根据体质量通过股动脉在10 min内匀速将40%的血容量(22.5 ml/kg)放出，放血速度为0.5 ml/min。抽出的血液储存在肝素化(7.5 U/ml)的无菌注射器内，储存于4℃冰箱中，待复苏时回输至大鼠体内。休克维持时间为30 min，30 min后，用输液泵回输放出的血和2倍放血量的乳酸林格氏液进行复苏，复苏期维持30 min。监测大鼠血流动力学8 h。

1.4实验分组62只大鼠随机分为3组：(1)对照组(C组，n=6)：麻醉、置管，不建立模型；(2)实验组(H组，n=28)，建立模型并复苏；(3)干预组(N组，n=28)，放血后立即给予AR-β2特异性拮抗剂ICI 118.551，0.5 mg/kg静脉注射[7]，余同H组。H组和N组分别在复苏后2、4和8 h处死6只大鼠，采血并留取骨骼肌标本待检测。H组和N组分别留取10只大鼠用于72 h生存分析。

1.5定量PCR法检测PGC-1 mRNA表达RNA提取：TRIzol一步法提取RNA。反转录：采用TaKaRa公司试剂盒合成cDNA，反应条件为37℃，15 min；85℃，5 s。PCR扩增：PGC-1引物序列，上游5′-agacagagcccagccagta-3′，下游5′-cccgtccttcagagcat-3′；β-actin引物序列，上游5′-tcatcaccattggcaatgag-3′，下游5′-cactgtgttggcgtacaggt-3′。PCR反应按下列条件循环：95℃、30 s，预变性，然后95℃、30 s，60℃、34 s，进行40个循环后，60℃、1 min延伸。根据标准曲线，荧光定量PCR仪自动分析并计算结果，按2-△△CT法计算目标基因在实验组和对照组中表达的相对水平。

1.6蛋白印迹法检测PGC-1蛋白表达组织加入5倍体积预冷的细胞裂解液，冰浴下匀浆，再用冰水浴超声粉碎。4℃下以12 000 r/min离心1 h，取上清液，考马斯亮蓝法进行蛋白定量。SDS-PAGE分离40 μg样品后，电转移至硝酸纤维膜上，封闭后，加入一抗(PGC-1，1∶500)室温下免疫沉淀1 h，摇洗后加入标记二抗(1∶2 000)，室温下作用2 h。ECL浸膜，显影。照片在图像分析仪上进行分析定量，记录相应蛋白条带的平均光强度值，并计算PGC-1和actin 吸光度值的比值。

1.7生化检测指标在模型建立前[休克时间hemorrhagic shock time(HST)0 min]、模型建立后(HST 30 min)、复苏后2 h(HST 180 min)及复苏后4 h(HST 300 min)分别检测红细胞比容(Hematocrit，Hct)、乳酸、剩余碱和血糖。

2　结果

2.1血流动力学指标HS模型建立后，大鼠MAP降至约40 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。模型建立120 min后，H组大鼠MAP为(84.0±10.7)mmHg，N组大鼠MAP为(72.0±11.7)mmHg；模型建立8 h后，H组和N组MAP分别为(105.0±8.2)mmHg和(94.0±10.0)mmHg。两实验组各个时间点MAP比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。HS模型建立后，大鼠心率升至约260 次/min。模型建立120 min后，H组大鼠心率降至(204.0±16.4)次/min，N组大鼠HR降至(182.0±12.7)次/min；模型建立8 h后，H组和N组心率分别为(194.0±12.8)次/min和(165.0±22.8)次/min。两实验组各个时间点心率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1　各组大鼠MAP变化，血压/mmHg)

表2　各组大鼠心率变化，心率/次·min-1)

2.2生化指标模型建立前后的各个时间点，H组和N组的Hct和血糖差异无统计学意义(P>0.05)。在建模后，H组和N组BE值分别从(-3.1±1.0)nmol/L和(-2.8±1.2)nmol/L下降至(-9.4±2.3)nmol/L和(-4.3±1.1)nmol/L，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，其后HST 180 min和HST 300 min，两组差异仍有统计学意义(P<0.05)。在建模后，H组和N组乳酸水平分别从(0.9±0.1)mmol/L和(1.1±0.3)mmol/L上升至(17.3±3.8)mmol/L和(9.4±2.7)mmol/L，差异有统计学意义(P<0.05)；同样，其后HST 180 min和HST 300 min，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。2.3PGC-1 mRNA表达对照组大鼠骨骼肌组织内可见PGC-1 mRNA表达；复苏结束2 h后，H组和N组大鼠的PGC-1 mRNA表达均明显升高，分别是对照组的(2.00±0.45)倍和(1.04±0.64)倍，H组与N组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。复苏4 h和8 h后，H组和N组PGC-1 mRNA表达都逐渐下降，但两组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

表3　模型建立前后生化指标变化±s)

注：与N组比较，①P<0.05

图1　PGC-1 mRNA表达变化(两组间2、4、8 h比较，P<0.05)

2.4PGC-1蛋白表达对照组大鼠肝脏组织内可见PGC-1蛋白的基础表达；复苏结束2 h后，H组大鼠的PGC-1蛋白表达明显增加，是建模前的(1.95±0.35)倍。而N组大鼠的PGC-1蛋白表达略有减少，是对照组的(0.91±0.30)倍，差异有统计学意义(P<0.05)。复苏4 h和8 h后，H组和N组PGC-1 蛋白表达逐渐下降，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

2.5生存情况H组和N组大鼠在休克期及复苏期均无死亡，H组大鼠5只存活到72 h，另外5只大鼠分别存活12、18、24、30及36 h；N组大鼠8只存活到72 h，2只死亡大鼠分别存活48 h和60 h。Kaplan-Meier生存分析显示，H组与N组差异有统计学意义(P<0.05)。

图2　PGC-1 蛋白表达变化

3　讨论

HS发生后，由于组织灌注不足，机体有氧代谢被抑制，无氧糖酵解增强，乳酸大量产生，能量代谢出现严重紊乱。如果代谢紊乱不能得到纠正，进一步发展会出现体温下降、凝血障碍、心肌收缩性下降和血管反应性降低，进而危及患者生命[8]。

血清乳酸水平的高低不但能反映HS时能量代谢紊乱的程度，还是预后判定的重要指标[1]。传统上认为，由于组织器官灌注不足导致的无氧糖酵解增强是导致高乳酸血症形成的唯一原因。但近年研究发现，除组织低灌注外，由于应激产生的高儿茶酚胺血症是乳酸大量生成的又一重要原因[3]。Luchette[9]在观察肾上腺素受体拮抗剂对HS时乳酸水平的影响中发现，联合应用肾上腺素α和β受体拮抗剂虽然对组织灌注没有影响，但却显著降低了血清乳酸水平。Levy[3]的研究进一步证实，HS发生后肾上腺素可通过激活AR-β2-Na+-K+-ATP酶通路增加有氧糖酵解，进而导致乳酸大量产生，与低氧同为HS时乳酸产生的重要原因。这些研究结果证实了笔者在前期工作中的发现，采用麻醉和非麻醉状态的巴马香猪分别建立HS模型，虽然失血量相同，但非麻醉HS猪的乳酸水平平均是麻醉HS猪的8倍[10]，考虑麻醉减轻HS造成的应激反应，降低血清儿茶酚胺水平，导致乳酸水平的下降。

AR-β2不但可以调节乳酸的生成，还可以调控寒冷、运动等应激状态下大鼠骨骼肌细胞内能量调控基因PGC-1的表达[5,11]。1998年，在小鼠体内发现PGC-1，其作为过氧化物酶体增殖物激活受体的转录辅激活因子，虽不直接结合DNA，但可通过与调节基因表达的结合转录因子相互作用诱导线粒体生物合成、呼吸和产热作用，还能调节核呼吸因子1和2等基因的表达[12-13]。PGC-1能停靠多种转录因子，增强靶基因转录效率，广泛参与多种代谢通路的调节活动，在适应性产热、线粒体生成、脂肪酸的β氧化及肝糖异生等过程中发挥着重要作用[14]。

本研究发现，休克复苏模型制备2 h后，大鼠骨骼肌细胞内PGC-1蛋白和mRNA的表达均呈先明显增高，而后逐渐下降的趋势。李伟文等[15]在研究单纯HS大鼠肠上皮细胞内PGC-1的表达变化时，也发现类似变化规律，发现HS后2～3 h肠上皮细胞内PGC-1的蛋白和mRNA表达明显升高，而后逐渐下降。PGC-1的mRNA和蛋白在休克早期合成增多是机体的适应性调节反应，以便在能量供给不足时，线粒体合成增加和功能加强。随着休克的进展，PGC-1的mRNA和蛋白的表达逐渐下降。目前，虽然其降低的机制尚不明确，但可考虑为能量代谢调控失代偿在分子水平上的表现。

给予AR-β2拮抗剂后，大鼠骨骼肌内PGC-1的mRNA和蛋白表达在模型制备后早期即明显下降，其后也一直维持在较低的水平。笔者认为，正是由于AR-β2拮抗剂抑制了休克时高肾上腺素血症引起的高代谢状态，因此，PGC-1的mRNA和蛋白表达才表现为适应性下调。这表明在HS的病理状态下，AR-β2仍能够通过反馈性调节调控PGC-1的表达，进而调节能量代谢。N组后期PGC-1蛋白和mRNA的低表达与H组的低表达也有不同的意义，前者是对相对低代谢需求的适应性调节，而后者是代谢耗竭后的失代偿表现。血清乳酸和剩余碱的变化反映了这种差异。给予AR-β2拮抗剂后的各个时间点，N组的乳酸和剩余碱水平只有H组的一半。同样，H组与N组大鼠的生存分析也证实N组具有明显的生存优势。因此，实验组两组虽然后期PGC-1蛋白和mRNA的表达都呈下降趋势，但其意义完全不同。

综上所述，本研究从能量代谢角度出发，在分子水平探讨了调控AR-β2治疗HS的机理，结果表明抑制休克时，高肾上腺素血症引起的代谢亢进有助于能量稳态的维持，为HS的治疗提供了新思路。

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基金项目：辽宁省自然科学基金(2013020218)；全军“12.5”医药卫生科研基金课题(CWS12J055)

通信作者：张雪峰，E-mail:cz1791@126.com

文章编号：2095-5561(2016)04-0220-05 中图分类号：R441.9；R641

文献标志码：A

收稿日期：2016-05-17

Effects of β2-adrenergic receptor on expressions of PGC-1 in rat model of hemorrhagic shock

ZHANG Cheng，GAO Guang-rong，LI Da，SHAN Yong-qi，ZHANG Xue-feng

(Department of General Surgery,General Hospital of Shenyang Military Area Command,shenyang,110840,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of β2-adrenergic receptor on expressions of PGC-1 in skeletal muscles in rat model of hemorrhagic shock.Methodsds SD rats were randomized into three groups:Control(C),Hemorrhage(H)and Hemorrhage+AR-β2 (N).Venous blood(22.5 ml/kg)was continously withdrawn over 10 minutes to establish hemorrhagic shock model.Selective β2-adrenoceptor antagonist ICI 118,551 (0.5 mg/kg)was intravenously administered after hemorrhage had finished.After 30 minutes shock periods,rats received whole blood and lactated Ringer′s solution resuscitation(1:2)for 30 minutes.Rats were monitored for 8h after resuscitation.Hematocrit(Hct),Base excess(BE),Lactate(Lac)and Glucose(Glu)were recorded at the baseline and different hemorrhagic shock time(HST).The expressions of PGC-1 mRNA and protein in skeletal muscles were tested by real-time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR)and western blotting.ResultsRats in Group N had lower lactate levels and higher BE levels than Group H (P<0.05).At 72 hours,there were five survivors in Group H and eight in Group N (P<0.05 versus Group H,Log Rank).Both Group H and Group N increased PGC-1 mRNA and protein expressions at 2 hours after resuscitation,but more higher expressions were seen in Group H compared with Group N (P<0.05).Thereafter,the expressions of PGC-1 mRNA and protein decreased gradually in both groups,and no statistic differences were found between the two groups.ConclusionAdrenergic receptor-β2 could regulate energy metabolism balance through adaptive regulation to PGC-1 during hemorrhagic shock.

Key words:Hemorrhagic shock；β2-adrenergic receptor；Peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator-1

第一作者：张成(1971-)，男，辽宁辽阳人，主任医师，博士