抗毒合剂的质量标准制订*

2016-08-12杜向红杜云锋李国峰林帅军

中医研究 2016年7期

关键词：草苷木犀绿原

杜向红，杜云锋，张　伟，李国峰，林帅军，刘　伟

(1.河南省人民医院，河南郑州 450008； 2.河南中医学院分析测试中心，河南郑州450046)

抗毒合剂的质量标准制订*

杜向红1，杜云锋1，张伟1，李国峰1，林帅军2，刘伟2

(1.河南省人民医院，河南郑州 450008； 2.河南中医学院分析测试中心，河南郑州450046)

目的:研究抗毒合剂的质量控制方法。方法:采用薄层色谱法对抗毒合剂中药材进行定性鉴别，采用高效液相色谱法测定抗毒合剂中绿原酸、木犀草苷的含量。结果:抗毒合剂中供试品薄层色谱中，在与对照品相应位置上显相同斑点；绿原酸、木犀草苷对照品分别在0.08～1.00 μg(r=0.999 9)、0.077 8～0.972 5 μg(r=0.999 9)范围内线性关系良好，平均加样回收率分别为98.93%、97.25%。结论:该质量控制方法简便准确、灵敏度高，可以用于抗毒合剂的质量控制。

抗毒合剂;绿原酸;木犀草苷;薄层色谱法;高效液相色谱法;质量标准

抗毒合剂为河南省人民医院经验配方，具有清热解毒的作用,临床主要用于治疗上呼吸道感染、病毒性肺炎、流行性腮腺炎等。抗毒合剂主要由大青叶、板蓝根、金银花、连翘、柴胡、葛根组成，采用水提醇沉法制成。其中金银花除有清热解毒之功效外，还有宣散风热、清解血毒之功；连翘有散结消肿之功；此两药共为君药。大青叶解毒、凉血、止血，板蓝根凉血消斑、利咽止痛，柴胡解表退热、疏肝解郁、升举阳气，三者均能辅助君药。本研究对抗毒合剂从定性鉴别、定量分析两方面来建立抗毒合剂的质量标准，从而更好地控制合剂的质量。

1　药品、试剂与仪器

抗毒合剂(批号20121101，20121201，20130101)和阴性样品均由河南省人民医院提供。绿原酸(批号091024)、连翘苷(批号110821)、葛根素(批号111224)、靛蓝(批号120325)、靛玉红(批号110915)，均购自北纳创联生物技术研究院；乙腈为色谱纯；水为蒸馏水；其他试剂均为分析纯。Agilent 1260高效液相色谱仪，美国安捷伦公司产品； AE240电子分析天平，瑞士METTLER公司产品。

2　方法与结果

2.1定性鉴别

2.1.1金银花的鉴别

取本品5 mL，置蒸发皿中，80 ℃蒸干，加甲醇5 mL 使溶解，滤过，浓缩至1 mL，作为供试品溶液。同法制备缺金银花阴性对照溶液。另按《中国药典》2010版一部中金银花项下方法制备金银花对照药材。再取绿原酸对照品适量，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010版一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述4种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(1∶15∶1∶1∶2)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254 nm)下观察。结果：供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点，而阴性对照无干扰。见图1。

1～3.供试品；4.对照药材；5.对照品；6.阴性对照品

2.1.2连翘的鉴别

取本品20 mL，用二氯甲烷振摇提取3次，每次10 mL，合并萃取液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，滤过，作为供试品溶液。同法制得缺连翘阴性对照溶液。另取连翘药材1 g，加甲醇20 mL，超声处理(功率250 W，频率35 kHz)30 min后滤过，浓缩至1 mL，作为对照药材溶液。再取连翘苷作对照品适量，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述4种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-冰醋酸(17∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茴香醛硫酸溶液，在100 ℃加热至斑点显色清晰。结果：供试品色谱中，在与对照药材和对照品相应位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照则无干扰。见图2。

1～3.供试品；4.对照药材；5.对照品； 6.阴性对照品

2.1.3葛根的鉴别

取本品20 mL，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次30 mL，合并萃取液，蒸干，加甲醇1 mL溶解，滤过，作为供试品溶液。同法制得缺葛根阴性对照溶液。另取葛根药材2 g，加甲醇30 mL，超声处理(功率250 W，频率35 kHz)30 min，滤过，浓缩至2 mL，作为对照品药材。再取葛根素对照品适量，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述4种溶液各5 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(16∶6∶0.8)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下观察。结果：供试品色谱中，在与对照药材和对照品相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。见图3。

1～3.供试品；4.对照品；5.对照药材；6.阴性对照品

2.1.4大青叶的鉴别[1]

取本品15 mL，用三氯甲烷振摇提取2次，每次20 mL，合并萃取液，蒸干，残渣加三氯甲烷1 mL，溶解，滤过，作为供试品溶液。同法制得缺大青叶阴性对照溶液。另取大青叶药材1 g，取甲醇20 mL，超声(功率250 W，频率35 kHz)30 min，滤过蒸干，用三氯甲烷定容至1 mL，作为对照品药材。再取靛蓝、靛玉红对照品适量，分别加三氯甲烷制成每毫升含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述5种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板，以氯仿-丙酮(15∶2)为展开剂，展开，取出，晾干。结果：供试品色谱中，在与对照药材和对照品相应的位置，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。见图4。

1～3.供试品；4.对照药材；5.靛玉红对照品；6.靛蓝对照品；7.阴性对照品

2.2绿原酸、木犀草苷的含量测定

按照参考文献[2-5]。

2.2.1色谱条件及系统适用性试验

色谱柱为Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5μm)柱。流动相为乙腈(A)-1 mL/L磷酸水溶液(B)梯度洗脱：0-21 min，10%→18% A；21-33 min，18%→23% A。检测波长：0-21 min，327 nm；21-33 min，360 nm。柱温25 ℃，流速1 mL/min，进样量10 μL。理论板数按绿原酸峰计算应不低于4 000。

2.2.2对照品溶液的制备

精密称取绿原酸对照品和木犀草苷对照品适量，置于100 mL棕色容量瓶中，加500 mL/L甲醇制成每毫升含绿原酸40 μg、木犀草苷38.9 μg的混合溶液。

2.2.3供试品溶液的制备

精密量取抗毒合剂1 mL，置50 mL的容量瓶中，用500 mL/L甲醇溶液定容至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.2.4阴性溶液的制备

按处方配比取除金银花以外的其他药材,照抗毒合剂的制法制成缺金银花阴性合剂, 再按供试品溶液的制备方法制得阴性对照品溶液。

2.2.5专属性试验

精密吸取供试品溶液、对照品溶液及阴性对照品溶液各10 μL,注入液相色谱仪中。结果：供试品色谱中，在与绿原酸和木犀草苷对照品相对应的保留时间检出相对应的色谱峰，缺金银花阴性对照品在绿原酸和木犀草苷相应的保留时间无色谱峰。见图5。

A.对照品；B.供试品溶液；C.阴性对照溶液

2.2.6线性关系考察

精密量取对照品溶液2,5,10,15,20,25 μL，按2.2.1项下色谱条件测定峰面积。以峰面积为纵坐标(Y)，进样量(μg)为横坐标(X)，绘制标准曲线，得回归方程分别为：绿原酸Y=11.263X+1.925 9(r=0.999 9)；木犀草苷Y=0.831 3X+0.107 6(r=0.999 9)。结果表明：绿原酸在0.08～1.00 μg范围内线性关系良好；木犀草苷在0.077 8～0.972 5 μg范围内线性关系良好。

2.2.7精密度试验

精密吸取同一对照品溶液10 μL，连续进样5次，以绿原酸和木犀草苷的峰面积计算，RSD值分别为0.20%、0.45%。结果表明：仪器精密度良好。

2.2.8重复性试验

取同一批号的供试品按2.2.3项下方法制备6份供试品溶液，分别精密吸取各供试品溶液10 μL，进样测定。以绿原酸和木犀草苷的峰面积计算，RSD值分别为0.13%、0.17% 。结果表明:方法重现性良好。

2.2.9稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于配制后 0,3,6,9,12,24 h，精密吸取 10 μL测定。结果：绿原酸和木犀草苷的峰面积RSD值分别为2.39%、2.36%。结果表明：供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.2.10加样回收率试验

取批号20130101已知含量(绿原酸1.307 8 g/L、木犀草苷0.905 2 g/L) 的样品0.5 mL，精密称取6份，分别加入含有绿原酸0.50 g/L、木犀草苷0.49 g/L 的混合对照品溶液1 mL，以下按2.2.3项下方法制备加样回收供试品溶液。精密吸取加样回收供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，测定结果见表1。