紫虎烧伤膏抗菌作用的研究

王　霞

郴州市第一人民医院(郴州 423000)



紫虎烧伤膏抗菌作用的研究

王霞

郴州市第一人民医院(郴州 423000)

【摘要】目的研究紫虎烧伤膏的抑菌作用强度。方法采用体外试验测定紫虎烧伤膏的MIC和MBC，纸片法比较紫虎烧伤膏和湿润烧伤膏对不同代表性菌种抑菌圈大小；动物实验比较紫虎烧伤膏和湿润烧伤膏用于大鼠Ⅱ度烫伤模型24 h,48 h后创面菌落计数。结果紫虎烧伤膏对金黄色葡萄球菌的MIC(Minimum inhibitory concentration)为8 mg/mL，MBC (Minimum bactericidal concentration)32 mg/mL；对铜绿假单胞菌的MIC为16 mg/mL，MBC32 mg/mL；对大肠杆菌的MIC为16 mg/mL，MBC64 mg/mL。抑菌圈试验结果显示，紫虎烧伤膏和湿润烧伤膏没有显著性差异。动物实验表明，紫虎烧伤膏和湿润烧伤膏均有不同程度的抑制大鼠Ⅱ度烫伤局部细菌的作用。紫虎烧伤膏的作用更强。用药时间越长，抑菌效果越明显。结论紫虎烧伤膏能够有效抑制Ⅱ度烧烫伤局部细菌，防止烧烫伤创面感染，保护创面，从而起到治疗Ⅱ度烫伤的作用。

【关键词】紫虎烧伤膏抗菌作用MIC(最低抑菌浓度)MBC(最低杀菌浓度)抑菌圈试验

烧伤创面是烧、烫伤感染中明显而主要的病原菌侵入途径,烧伤后创面及全身感染是患者致死的主要原因。可以说，感染是直接影响烧、烫伤创面愈合的关键。控制感染是烧伤治疗过程中极其重要的环节。局部用药仍是烧、烫伤治疗中控制感染的重要治疗手段。紫虎烧伤膏是用于烧伤烫伤治疗的正在研发的医院制剂，是采用现代制剂工艺方法研制而成的中药外用复方制剂,主要由紫草[1]、虎杖等药等组成,具有清热解毒、消肿止痛、敛疮生肌之功效[2]。为了考察紫虎烧伤膏防治烧烫伤后感染的效果，我们通过体外试验对其对烧伤感染常见致病菌的抗菌活性进行了测定。采用大鼠Ⅱ度烫伤模型对紫虎烧伤膏在活体动物试验中的抑菌效果进行了试验考察。试验经郴州市第一人民医院伦理委员会同意并在其监督下进行，试验后动物采用麻醉处死办法处理。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要仪器不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产；SHP-250型生化培养箱，上海精宏实验设备有限公司生产；Air Tech超净工作台，苏净集团安泰公司制造。

1.1.2药品和试剂紫虎烧伤膏，自制，批号20120311；湿润烧伤膏[3]，汕头市美宝制药有限公司生产，批号20111206；营养肉汤培养基，杭州微生物试剂厂生产；M-H琼脂培养基，杭州天和微生物试剂有限公司生产。试验中的药品均为药用级，试剂均为分析纯级。

1.1.3菌株[4]金黄色葡萄球菌 (ATCC25923)，来自郴州市第一人民医院检验科；铜绿假单胞菌[5](ATCC22853)，来自郴州市第一人民医院检验科；大肠杆菌(ATCC25922)，来自郴州市第一人民医院检验科；标准比浊管，来自郴州市第一人民医院检验科。

1.1.4实验动物清洁级SD大鼠，雌雄各半，体重180～220 g，购自中南大学湘雅医学院动物学部，合格证号：SCXK(湘 2012-0002)。

1.2方法

1.2.1供试溶液的制备

1.2.1.1样品溶液的制备分别取湿润烧伤膏，紫虎烧伤膏药物用吐温80(45℃)搅拌均匀，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液充分乳化，制备成浓度为1.28 g/mL的样品溶液。

1.2.1.2阴性样品溶液的制备按样品溶液制备项下方法不加药物，同法制成阴性样品溶液。

1.2.1.3菌液的制备分别接种金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，35℃ 恒温箱培养(20±1)小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释，调整浓度为0.5麦氏比浊管。用营养肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后得到1～2×106CFU/mL的菌液，备用。

1.2.2药物最小抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定方法采用试管二倍稀释法对药物最小抑菌浓度(MIC)进行测定[6]。基内培养法测定最低杀菌浓度。琼脂扩散打孔法测抑菌圈大小。

1.2.2.1试管二倍稀释法测定MIC样品溶液的稀释、制备及菌液接种 严格无菌操作，取3组无菌试管(13×100 mm，每组代表1个菌株)各13支，每组各2个样品(紫虎烧伤膏，湿润烧伤膏)共排成一排，除第1，12，13管加入1.8 mL营养肉汤外，其余每管加入营养肉汤1 mL，在第1管加入1.28 g/mL的样品溶液0.2 mL混匀，第13管加入阴性样品溶液0.2 mL。然后从第1管吸取1 mL至第2管，混匀后再从第2管吸取1 mL至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1 mL弃去，第12管为不含药物的菌液阳性生长对照。然后在每管内加入上述制备好的菌液各0.1 mL，使每管最终菌液浓度约为0.5～1×105CFU/mL。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125 mg/mL。以上各管至35℃培养(22±1)小时，肉眼观察未发生混浊的最小药物浓度为最小抑菌浓度(MIC)。结果见表1。

1.2.2.2基内接种法测最低杀菌浓度(MBC)取试管两倍稀释法中无细菌生长管,用无菌操作法分别全部倒入已灭菌的培养皿中,再分别倒入已融化并冷却至 45℃～50℃左右的营养琼脂培养基,轻轻摇动培养皿,使菌液与培养基混合均匀,待冷凝后将培养皿翻转于 35℃培养(36±2)h,观察结果。以菌落数不超过5个的平板所对应的小试管的最低药物浓度即为该药物的最低杀菌浓度(MBC)。结果见表1[7]。

表1　二倍稀释法测定MIC(mg/mL)、MBC(mg/mL)

1.2.3抑菌圈大小测定用无菌棉拭子蘸取浓度为0.5麦氏比浊管菌液，在管壁上挤压去掉多余菌液。用棉拭子涂布整个M-H培养基表面，反复几次，涂均匀。取3组无菌平皿(直径15 cm，每组代表1个菌株)各5个，每组各2个样品(紫虎烧伤膏，湿润烧伤膏)共排成一排，取直径5 mm左右无菌纸片分别浸泡于紫虎烧伤膏，湿润烧伤膏样品溶液，阴性样品溶液中，浸透。用无菌镊子取浸透样品溶液的纸片贴在平板表面。每个平板贴4张纸片，其中3张为同一样品溶液纸片，另外一张为阴性样品溶液纸片。每张纸片间距不少于24 mm，纸片中心距平皿边缘不少于15 mm。将平板反转，35℃孵育(20±2)h小时后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径。(用ATCC 25922大肠杆菌(Escherichia coli)做质控。只有当质控菌株的抑菌圈直径在允许范围内测试菌株的结果才可以报告)。结果见表2。

菌种n紫虎烧伤膏湿润烧伤膏金黄色葡萄球菌1512.58±0.5112.44±0.82铜绿假单胞菌158.04±0.508.45±0.88大肠杆菌1511.05±1.7510.94±1.38

注：与湿润烧伤膏比较，P>0.05，二者抑菌圈试验无差异。

1.2.4大鼠感染性Ⅱ度烫伤模型创面抑菌试验50只体重180～220 g大鼠于实验前24 h,用硫化钠脱毛,面积约30 cm2,用戊巴比妥钠(30 mg /kg)腹腔麻醉,浸入100℃水浴槽孔(面积约30 cm2)内持续烫15 s,造成约10%Ⅱ度烫伤创面。伤后5 min,用苦味酸划出创面边界,计算面积,立即腹腔注射5%葡萄糖盐水复苏。并取经培养制备浓度为1. 0×108cfu/mL金黄色葡萄球菌0.5 mL,均匀涂布于创面上。将50只大鼠随机分为5组,即湿润烧伤膏组,紫虎烧伤膏低中高0. 524、1.048、2.096 g/g3个剂量组及赋形剂组。于动物伤后10 min分别对烫伤局部施以相应外用药并予以包扎。各治疗组每日换药一次,于感染后24 h、48 h各采样一次作创面菌落计数。采样时,用3只消毒无菌棉签轻浸渍肉汤并挤干,先后由创面一侧向另侧滚动均匀涂抹创面一次,并立即置入盛5 mL无菌肉汤培养液中。将标本充分振荡80～100次,用无菌吸管吸取1 mL至9 mL 1%蛋白胨水稀释液中混匀,按此法连续稀释至10-2、10-3、10-4、10-5倍,吸取每一稀释液分别注入到3个灭菌平皿内,每皿1 mL。将熔化并冷却到45～50℃的营养琼脂注入平皿,每皿15 mL,以另一不加标本的空白皿作为对照。转动平皿使标本与菌液充分混合均匀,待凝固后,翻转平皿并于35℃孵育(22±2)h,观察结果,计数菌落,以求得标本中所含活菌数。并折算出单位创面面积所含细菌菌落数。以t检验测定各治疗组与赋形剂对照组组间的差异显著性。同时进行3个治疗剂量组间等效性分析。

表2　大鼠Ⅱ度烫伤模型创面菌落计数表

注:△与湿润烧伤膏组相比，有显著性差异(P<0.05)；*与赋形剂组相比，有极显著差异(P<0.01)

2讨论

2.1二倍稀释法测量药物的MIC试验中阳性菌试验管和阴性样品溶液试验管试验菌生长良好，可以排除菌种因素和赋形剂对实验结果的影响。

2.2纸片法测定分别紫虎烧伤膏和湿润烧伤膏的抑菌圈大小，结果表明二者之间对3种试验菌均有一定抑制作用，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌圈直径大于铜绿假单胞菌抑菌圈直径，抑菌效果更明显。两种药物对3种菌种抑菌圈大小比较，没有显著差异。

2.3动物创伤模型活体用药后24 h、48 h分别计量创面菌落数，结果表明紫虎烧伤膏低中高剂量组对创面均有明显抑制细菌生长的作用，与赋形剂对照组比较有显著性的差异。随着创面用药时间延长，抑菌效果更显著。紫虎烧伤膏中高剂量组染菌24 h后菌落计数与湿润烧伤膏组(剂量与紫虎烧伤膏中剂量组相当)比较有显著差异，紫虎烧伤膏高中低3个剂量组之间组间剂量等效性结果分析表明，除低剂量组抑菌效果较差外，其余2个剂量组基本等效。可以采用中剂量组配比给药。

2.4紫虎烧伤膏是纯中药制剂，对2度烧烫伤抑菌效果明显，且随着用药时间的延长效果更好。这对于保护创伤组织，促进创面愈合具有重要作用。

参考文献：

[1] 林森.紫草烧伤膏治疗二度烧伤临床观察[J]. 实用中医药杂志，2012, 28(10):863.

[2] 于豪.中药及榆烧伤止痛膏创新治疗烧烫伤78例[J]. 中医临床研究，2015, 7(26):100-101.

[3] 赵丽华.美宝湿润烧伤膏治疗小面积烧伤创面142例[J]. 实用医药杂志，2012, 29(12):1081-1082.

[4] 谢懿，曾娟，李忠新. 临床微生物培养结果与抗菌药物使用相符情况分析[J]. 现代医院，2013, 13(12):29-30.

[5] 汤凤珍，张伟红，欧阳英娥，等. 多重耐药铜绿假单胞菌相关耐药基因的研究[J]. 广州医药，2012, 43(4):51-53.

[6] 章怀凤，李勇敏，朱克俭. 复方桐叶烧伤油的抗菌作用研究[J]. 湖南中医杂志，2012,28(3):46- 47.

[7] 段晓杰，杜晓丹，张蓓蓓. 纳米银对金黄色葡萄球菌的抗菌作用及其机制研究 [J]. 生物医学工程与临床,2015, 19(3):237-240.

DOI：10.3969/j.issn.1000-8535.2016.02.010

(收稿日期：2015-11-16)

Study on the antibacterial effect of purple tiger burn ointment

WangXia.

ChenzhouFirstPeople’sHospital,Chenzhou423000,China

【Abstract】ObjectiveTo study the antibacterial effect of the purple tiger burn ointment.MethodsThe MIC and MBC were determined by using in vitro test. Comparison of the inhibition zone size of the different representative strains of the purple tiger burn ointment and the moist burn ointment were made, the animal experiment was used to compare the colony count of the wound of the rat model of second degree scald after 24 h, 48 h with the purple tiger burn ointment and the moist burn ointment.ResultsMIC(Minimum inhibitory concentration)of purple tiger burn ointment on Staphylococcus aureus was 8 mg/mL, MBC(Minimum bactericidal concentration ) of purple tiger burn ointment on Staphylococcus aureus was 32 mg/mL; MIC of purple tiger burn ointment on Pseudomonas aeruginosa was 16 mg/mL, MBC of purple tiger burn ointment on Pseudomonas aeruginosa was 32 mg/mL, MIC of purple tiger burn ointment on Escherichia coli was 16 mg/mL, MBC of purple tiger burn ointment on Escherichia coli was 64 mg/mL. The results showed that there was no significant difference between the purple tiger burn ointment and the moist burn ointment. Animal experiments showed that the purple tiger burn ointment and the moist burn ointment had different degrees of inhibition of the role of local bacteria in the second degree scald in rats. Purple tiger burn cream showed stronger function. The longer the time took, the more obvious the antibacterial effect was.ConclusionThe purple tiger burn ointment can effectively inhibit the second degree burn of local bacteria, prevent the wound infection and protect the wound, so as to play a role in the treatment of second degree scald.

【Key words】The purple tiger burn ointment; Antibacterial action; MIC (minimum inhibitory concentration); MBC (minimum bactericidal concentration); Antibacterial circle test