血糖波动对糖尿病胃轻瘫大鼠Cajal间质细胞的影响及其机制研究

王　艳　黄　萍　廖淑金

广州医科大学附属市一人民医院老年病科内分泌专科(广州 510180)



·论著·

血糖波动对糖尿病胃轻瘫大鼠Cajal间质细胞的影响及其机制研究

王艳黄萍廖淑金

广州医科大学附属市一人民医院老年病科内分泌专科(广州 510180)

【摘要】目的探讨糖尿病胃轻瘫大鼠不同血糖水平对Cajal间质细胞(ICC)的影响及其机制。方法选择雌性Wista大鼠60只进行随机分组，实验组40只，对照组20只。实验组糖尿病Wista大鼠模型以单次腹腔注射链脲佐菌素法诱导。免疫组织化学荧光染色检测不同血糖浓度大鼠胃ICC数量及网络结构。结果实验组大鼠血糖浓度高于对照组，ICC数量，低于对照组，且比较差异有统计学意义(P<0.05)。实验组大鼠中血糖浓度越高，ICC数量越低，说明血糖浓度升高可能与平滑肌及神经末梢之间缝隙连接的减少及其ICC网络的超微结构损伤及异常有关。结论DM小鼠胃组织中血糖水平的升高，可能是DM胃中ICC数量减少的原因；外源性降低血糖能改善DM相关的胃肠道ICC病变。

【关键词】血糖糖尿病胃轻瘫胰岛素cajal间质细胞

研究发现,糖尿病胃轻瘫患者及动物模型存在平滑肌及神经末梢之间缝隙连接的减少及其ICC网络的超微结构损伤及异常。因此ICC的异常可能是糖尿病胃轻瘫的重要发病机制。本研究通过诱导糖尿病胃轻瘫的Wista大鼠模型，检测不同血糖浓度大鼠胃cajal间质细胞变化，探讨血糖波动对糖尿病胃轻瘫大鼠ICC的影响及其病理生理学机制。

1资料与方法

1.1实验动物普通级英国种短毛雌性Wista大鼠40只，体质量170～230 g。实验Wista大鼠购于上海松联实验动物场，动物实验得到广州医科大学附属市一人民医院伦理委员会批准。

1.2糖尿病Wista大鼠模型建立使用全价饲料将60只Wista大鼠适应性喂养1周后随机分成2组：实验组40只，对照组20只。链尿佐菌素(STz，Sigma公司)溶于新鲜配制的浓度0.1 moL/L、pH 4.4枸橼酸缓冲液中。正常对照组注射相应剂量空白枸橼酸缓冲液，实验组Wista大鼠按200 mg/kg体质量单次腹腔注射STZ。3天后测定Wista大鼠血糖，每周1次，连续4周，随机血糖≥16.7 mmoL/L为糖尿病Wista大鼠；血糖<16.7 mmoL/L为诱导失败，在实验中摒弃。实验组诱导成功糖尿病Wista大鼠40只。

1.3组织取材将Wista大鼠脱臼法处死，取出胃，反复用生理盐水清洗，剔除胃黏膜层，部分胃组织剪成1 cm×1 cm组织块，OCT包埋，液氮速冻保存，备行免疫组织化学染色。部分胃组织剪成1 mm×5 mm长条形存于5%戊二醛溶液中同定，以备用于透射电镜观察。

1.4免疫组织化学染色将胃组织于-20℃冰箱预冷20 min，用恒冷冰冻切片机切厚8 μm切片，黏于多聚赖氨酸处理的载玻片，晾干后，冷丙酮固定15 min，-20℃保存。室温风干切片、漂洗采用磷酸盐缓冲液(PBS)、孵育采用l%牛血清白蛋白(BSA)。一抗为大鼠抗小鼠vimentin抗体(DAKO公司)及kif单克隆抗体(R&D公司)；二抗为链霉亲和素一生物素一过氧化物酶复合物(SABC，大鼠IgG)-异硫氰酸荧光素(FITC)试剂盒及SABC(小鼠IgG)一cy3(武汉博士德公司)。4’，6．二脒基-2一苯基吲哚(DAPI)染色，甘油封片，荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察。每张切片选取3～5个视野，每个视野选择10个层面，每层0.3 μm的厚度进行3D扫描。图片用Image-Pro Plus 6.0软件进行量化处理，以ICC与胃组织面积百分比进行定量分析。

1.5激光共聚焦显微镜检测将标本放入Zam-boni液中固定，4℃6 h，行冰冻切片，将切好的冰冻组织切片(厚5 μm)放人冷丙酮固定，PBS冲洗；用5%BSA(溶于含0.3%Triton X-100的PBST中)封闭1 h；加入一抗(兔抗VAChT 1：100，羊抗C-Kit 1：100)，37℃孵育1.5 h，4℃过夜，PBS冲洗；加入二抗(FITC-驴抗羊IgG 1：200，TRITC一牛抗兔IgG 1：200)，37℃避光孵育1 h，PBS冲洗；抗荧光衰减封片剂封片，镜检观察。采用双通道同步扫描，扫描分辨率1 024 dpi，每一标本随机选取3个高倍视野，用图像分析软件进行图像的三维重建和荧光值定量分析。

2结果

2.1各组大鼠血糖、ICC数量的变化比较实验组大鼠血糖浓度高于对照组，ICC数量，低于对照组，且比较差异有统计学意义(P<0.05);实验组大鼠中血糖浓度越高，ICC数量越低，说明血糖浓度升高可能与平滑肌及神经末梢之间缝隙连接的减少及其ICC网络的超微结构损伤及异常有关。见表1。

表1　各组大鼠血糖、ICC数量的变化比较

注：与对照组比较，*P<0.05

2.2各组胆碱能神经-ICC网络结构的变化对照组ICC细胞形态饱满，呈梭形，有多个突起，ICC相互之间通过突起紧密连接，形成网络样结构。胆碱能神经-ICC-平滑肌细胞网络结构完整。血糖16.7～20 mmol/L组和血糖21～25 mmol/L组ICC超微结构较为正常完整，胆碱能神经-ICC网络结构基本完整。血糖>30 mmol/L组和血糖26～30 mmol/L组ICC细胞形态模糊，数量较少，胆碱能神经-ICC-平滑肌细胞网络结构紊乱。见图1。

图1　各组胆碱能神经-ICC网络结构的变化(X400)

A：对照组；B：血糖>30 mmol/L组；C：血糖16.7～20 mmol/L组；D：血糖21～25 mmol/L组；E：血糖26～30 mmol/L组。

3讨论

糖尿病胃运动功能障碍是糖尿病常见的一种慢性并发症,10年以上患者胃神经肌肉功能异常发生率高达30%～50%,其主要特点是胃动力下降、排空迟缓,从而导致胃潴留。糖尿病胃动力障碍的发病机制尚未明确,目前认为可能与植物神经病变、平滑肌变性、高血糖等因素有关。Cajal间质细胞是胃肠道的起搏细胞,ICC异常会影响平滑肌细胞内的慢波,从而影响平滑肌正常的收缩运动,导致整个胃肠动力障碍。ICC产生慢波并传导电兴奋，参与神经信号的传递，控制胃肠道运动h113；e-kit是ICC特异性表达的酪氨酸激酶受体。临床研究发现，糖尿病患者胃窦和结肠的ICC较非糖尿病者减少，同时存在ENS功能失衡，但胰岛素治疗对其影响尚不明确。在糖尿病胃肠功能紊乱的发病机制中，ENS起着重要作用。胃肠组织cajal间质细胞数量减少及结构破坏有关;理论上控制血糖可改善或纠正ICC变化及相关症状。研究发现糖尿病大鼠胃ENS的Ach阳性细胞较对照组染色加深，分布不均匀，空泡增多，面密度及累积光密度均低于健康对照组，这种变化在口服降糖药组更显著，提示糖尿病对Ach表达有明显的破坏或抑制作用，而胰岛素对上述变化有一定的保护作用。本实验中，实验组大鼠血糖浓度高于对照组，ICC数量，低于对照组，且比较差异有统计学意义(P<0.05)；实验组大鼠中血糖浓度越高，ICC数量越低，说明血糖浓度升高可能与CC网络的异常、超微结构的损伤及其与神经末梢及平滑肌之间缝隙连接的减少有关。而相关研究发现DM小鼠经外源性血糖干预后，血清中血糖与正常对照组相似，且ICC的数量、超微结构得到部分改善，该结果与干预时间、给药途径、剂量等是否有关，尚待验证。提示DM小鼠胃组织中血糖水平的升高，可能是DM胃中ICC数量减少的原因；外源性降低血糖能改善DM相关的胃肠道ICC病变。

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DOI：10.3969/j.issn.1000-8535.2016.02.001

(收稿日期：2015- 09-15)

Effects of blood glucose fluctuations on Cajal interstitial cells of rats with diabetic gastroparesis an its mechanistic studies

WangYan,HuangPing,LiaoShujin.

DepartmentofGeriatrics，GuangzhouFirstPeople’sHospitalAffiliatedtoGuangzhouMedicalCollege，Guangzhou510180，China

【Abstract】ObjectiveTo observe the effects of glucose fluctuations on Cajal interstitial cells (ICC) of rats with diabetic gastroparesis(DGP) and its mechanistic.Methods60 Wistar rats were selected and randomly divided into two groups. 20 rats in experimental group and 40 rats in control group. Used immunofluorescence staining to detect the amount of gastric ICC and network structure in DGP rats with different glucose levels.ResultsThe blood glucose concentration in the experimental group was significantly higher than that in the control group, the amount of ICC in the experimental group was significantly lower than that in the control group(P<0.05). The amount of ICC decreased with the increase of glucose levels. In the experimental group, The gap junctions between smooth muscle and nerve endings, ultrastructural damage and abnormalities of the ICC network were probably related to glucose level.ConclusionThe increase of glucose level was probably the cause of the decrease of the amount in ICC. Exogenousy decrease glucose levels probably can help to improve the lesion of ICC with DGP.

【Key words】Blood glucose; Diabetes; Gastroparesis; Insulin; Cajal interstitial cells