丹蒌片对同型半胱氨酸诱导的兔主动脉内皮细胞CHOP、BIP蛋白表达和凋亡的影响*

张　妍,史占江,牛春玲,沈晓君

河南中医药大学基础医学院病理与病理生理学学科 郑州 450046



丹蒌片对同型半胱氨酸诱导的兔主动脉内皮细胞CHOP、BIP蛋白表达和凋亡的影响*

张妍,史占江,牛春玲,沈晓君#

河南中医药大学基础医学院病理与病理生理学学科 郑州 450046

摘要目的：观察丹蒌片对同型半胱氨酸(HCY)诱导的兔主动脉内皮细胞凋亡及内质网应激相关蛋白C/EBP 环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(CHOP)、免疫球蛋白重链结合蛋白(BIP)表达的影响。方法：以 HCY诱导建立兔主动脉内皮细胞损伤模型，分别用瑞舒伐他汀(他汀)、丹蒌片含药血清或二者联合共同培养48 h后，Annexin V-PI法检测细胞凋亡率，Western blot法检测CHOP、BIP蛋白表达情况。以未诱导细胞作空白对照。结果：模型细胞凋亡率及BIP、CHOP蛋白表达水平均高于空白对照(P<0.05)。丹蒌片和他汀可明显降低模型细胞的凋亡率，二者具有协同作用(F丹蒌片=475.288,F他汀=235.248,F交互=121.377,P<0.05)；丹蒌片可显著下调模型细胞BIP、CHOP蛋白的表达水平，与他汀无协同作用(F丹蒌片=7.017,8.147,P均<0.05；F交互=0.590,1.406,P均>0.05)。结论：丹蒌片可通过下调CHOP、BIP的表达抑制血管内皮细胞凋亡。

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)发病原因复杂多变。研究[1-2]证实，与冠状动脉疾病、脑血管病存在明显相关性的高同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)血症是AS的一个独立危险因素。HCY可造成血管内脂质堆积、内皮细胞损伤、巨噬细胞吞噬和平滑肌细胞增殖，大量堆积的游离脂质损伤内质网，导致内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[3-4]，从而引起AS斑块的形成和破裂。ERS可通过未折叠蛋白质应答(unfolded protein response，UPR)激活 C/EBP 环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)，因而CHOP被视为ERS的标志之一[5]。同样ERS发生时免疫球蛋白重链结合蛋白(immunoglobulin heavy chains binding protein，BIP)的表达也升高[6]。作者体外培养并用HCY诱导兔主动脉内皮细胞, 制备血管内皮细胞损伤模型观察在防治心脑血管疾病药物丹蒌片和对照药物瑞舒伐他汀作用下，模型细胞凋亡情况及BIP、CHOP的表达水平，为丹蒌片抗 AS 药理学作用的研究提供实验数据和理论基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物雄性普通级健康新西兰大耳白兔, 6月龄，体重2.0～2.3 kg,由河南康达实验动物有限公司提供,动物合格证号SCXK(豫)2010-0001。

1.1.2药品和试剂丹蒌片购自吉林康乃尔药业有限公司,批号20130305;瑞舒伐他汀(他汀)购自阿斯利康制药有限公司,批号125621;HCY、β-actin为Sigma公司产品; Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司；FITC标记二抗为Abcam公司产品；BIP，批号3158-2, 相对分子质量78 000,北京前景科创生物公司产品;CHOP(GADD153),批号bs-1362R,相对分子质量27 000,北京博奥森生物公司产品;兔主动脉内皮细胞购自美国San Diego 细胞应用公司。

1.1.3主要仪器CO2恒温培养箱，日本 Sanyo 公司产品；FACSCalibur型流式细胞仪，BD公司产品；FLUOVIEW FV100共聚焦荧光显微镜，德国莱卡仪器有限公司产品；JY-SCZ蛋白垂直电泳仪，北京东方电泳设备有限公司产品；DYCZ-40D转膜仪，北京六一仪器厂产品；Alpha Imager 2200紫外线成像仪，美国Alpha Innotech公司产品。

1.2含药血清的制备以5倍的临床剂量对兔用药，每日分2次灌胃，持续5 d，最后一次给药后1 h，从腹主动脉中抽取全血，离心取血清层备用。

1.3实验分组将兔主动脉内皮细胞稀释至1×108L-1后，接种在含胎牛血清的DMEM 培养基中，继续培养后将细胞分为空白对照组、模型组、他汀组、丹蒌片组、他汀+丹蒌片组，每组6个复孔。除空白组外，其余组均加入适量终浓度为10-4mol/L 的HCY诱导24 h，然后他汀组、丹蒌片组、他汀+丹蒌片组分别加入相应的含药血清，培养48 h后收集细胞。

1.4观察指标

1.4.1Annexin V-PI方法检测细胞凋亡率用PBS洗涤收集的细胞，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化，收集转移，吹打混匀，1 000 r/min 4 ℃离心 10 min，弃上清，加入冷 PBS 1 mL，轻轻振荡使细胞悬浮，调整细胞密度至1×106mL-1，取0.5 mL细胞悬液，1 000 r/min 4 ℃离心3 min，弃上清，将细胞重悬于200 μL Binding Buffer,加入Annexin V-FITC 10 μL和 PI 5 μL，轻轻混匀，避光室温反应15 min,加入Binding Buffer 300 μL，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5统计学处理采用SPSS 19.0分析，模型组和空白对照组间各指标的比较采用两独立样本t检验， 采用析因设计的方差分析评判丹蒌片和他汀对模型细胞凋亡、CHOP和BIP蛋白表达的影响，检验水准α=0.05。

2结果

2.1细胞凋亡检测结果模型组细胞凋亡率为(14.113±0.744)%，高于空白对照组的(0.367±0.350)%(t=40.937，P<0.001)，提示HCY可导致兔主动脉内皮细胞凋亡。他汀、丹蒌片均可显著抑制模型细胞凋亡，二者联合抑制作用更强(表1)。

表1　丹蒌片和他汀对模型诱导细胞凋亡率的影响(n=6)　%

F丹蒌片=475.288，F他汀=235.248，F交互=121.377，P<0.001。

2.2BIP、CHOP 蛋白表达检测结果见图1，表2、3、4。表2提示，HCY诱导的兔主动脉内皮细胞(模型组)BIP、CHOP表达较空白对照组升高。表3、表4提示，丹蒌片可显著降低模型细胞BIP、CHOP的表达，他汀可显著降低BIP的表达；二者对降低BIP、CHOP的表达无协同作用。

1：空白对照组； 2：模型组；3：他汀组； 4：丹蒌片组； 5：他汀+丹蒌片组。 图1　Western blot检测细胞中BIP、CHOP蛋白的表达

组别nBIPCHOP空白对照组60.350±0.3200.547±0.374模型组61.473±0.4291.393±0.763t5.1402.439P<0.0010.035

表3　丹蒌片和他汀对模型细胞BIP表达的影响(n=6)

F丹蒌片=7.017，P=0.015;F他汀=5.777，P=0.026;F交互=0.590，P=0.452。

表4　丹蒌片和他汀对模型细胞CHOP表达的影响(n=6)

F丹蒌片=8.147，P=0.010;F他汀=3.092，P=0.094;F交互=1.406，P=0.250。

3讨论

AS及其所导致的心脑血管疾病是当今人类死亡的首位原因[7]，其确切的病因至今尚未完全阐明，因此，AS发生机制及治疗靶点成为目前研究的热点[8]。

研究[9]证实HCY诱导ERS引起的血管内皮细胞凋亡是AS发生的关键性环节。内质网是细胞内蛋白质合成折叠、脂质合成和Ca2+储存的主要位置。HCY是AC发生的独立危险因子，HCY所含的巯基作为还原性物质可改变内质网内的氧化还原状态，使大量未折叠或错误折叠蛋白在内质网中蓄积，进而使内质网稳态失衡，引起应激反应，称为ERS[10]。BIP(GRP78)是内质网的一种分子伴侣，在辅助蛋白质折叠、稳定内质网中Ca2+水平、调节ERS跨膜信号感受器活性方面发挥重要功能，显示出细胞保护的潜在作用[11]。ERS早期，BIP表达迅速增加，可帮助变性蛋白重新折叠, 恢复蛋白质的正确构象，缓解ERS；当ERS持续时间过长、内质网功能失衡时, 大量促凋亡蛋白被激活，诱导ERS反应性细胞凋亡。CHOP也是 ERS 特异性促凋亡因子，研究[12]发现ERS 通过 UPR激活 CHOP，CHOP还可被ERS的各种刺激因素所激活。故BIP、CHOP可反映内质网应激状态。

丹蒌片由瓜蒌皮、泽泻、葛根、丹参、黄芪、赤芍等组成，具有活血化瘀、宽胸通阳、益气通脉、化痰散结之作用，在心脑血管疾病的预防和治疗中作用显著。该研究结果显示， HCY可以明显促进兔主动脉内皮细胞凋亡，BIP、CHOP表达显著升高，证实HCY诱导ERS引起的血管内皮细胞凋亡参与了AS的发生；丹蒌片对HCY诱导的血管内皮细胞凋亡具有抑制作用，且与他汀可协同用药；丹蒌片可降低HCY诱导的兔主动脉内皮细胞中BIP、CHOP蛋白的表达。该研究结果提示丹蒌片可通过下调BIP、CHOP蛋白表达抑制血管内皮细胞凋亡，其可与他汀协同作用，发挥抗AS作用。

参考文献

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(2015-09-11收稿责任编辑王曼)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.007

#通信作者，女，1955年5月生，硕士，教授，研究方向：心血管疾病的中医药防治，E-mail:shenxiaojun0628@163.com

中图分类号R543.5

关键词丹蒌片；C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白；免疫球蛋白重链结合蛋白；血管内皮细胞；凋亡；兔

Effect of Danlou tablet on CHOP,BIP protein expressions and apoptosis of rabbit aortic endothelial cells

ZHANG Yan,SHI Zhanjiang, NIU Chunling, SHEN Xiaojun

DisciplineofPathologyandPathophysiology,BasicMedicalCollege，HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450046

Key wordsDanlou tablet;C/EBP-homologous protein;immunoglobulin heavy chains binding protein;vascular endothelial cell;apoptosis;rabbit

AbstractAim: To study the effect of Danlou tablets on the apoptosis of rabbit aortic endothelial cells induced by homocysteine(HCY) and the expressions of endoplasmic reticulum stress related proteins C/EBP-homologous protein(CHOP) and immunoglobulin heavy chains binding protein(BIP). Methods: There were 5 groups. The blank group: aortic endothelial cells were not induced by HCY; the model group: aortic endothelial cells were induced by HCY; Danlou group, rosuvastatin group and combination group: aortic endothelial cells were induced by HCY and then cultured for 48 hours by serum containing Danlou tablet, rosuvastatin or rosuvastatin and Danlou tablet, respectively. Apoptosis rate and expressions of CHOP and BIP protein were detected by Annexin V-PI and Western blot. Results: Compared with blank group, apoptosis rate, the expressions of CHOP and BIP protein in model group increased significantly(P<0.05). Both Danlou tablet and rosuvastatin could decrease apoptosis rate of cells with HCY induction, and there was synergistic effect between them(FDanlou tablets=475.288，Frosuvastatin=235.248，Finteraction=121.377，P<0.05). Danlou tablet could decrease the expressions of BIP and CHOP protein(FDanlou tablets=7.017，8.147, P<0.05), but had no synergy with rosuvastatin(Finteraction=0.590,1.406，P>0.05).Conclusion: Danlou tablet could inhibit the apoptosis of vascular endothelial cells by down-regulating the expressions of CHOP and BIP protein.

*国家自然科学基金资助项目81273949；河南省基础与前沿技术研究项目072300450030；河南省教育厅科学技术研究重点项目13A310612；河南中医药大学科研苗圃工程MP2015-10