废纸脱墨浆预处理及其酶解性能研究

杨淑娟, 游艳芝, 卜令习, 李晓利, 蒋建新*

(1. 北京林业大学 材料科学与技术学院；林业生物质材料与能源教育部工程中心，北京 100083;2. 国网节能服务有限公司 北京生物质能源技术中心，北京 100053)



废纸脱墨浆预处理及其酶解性能研究

杨淑娟1, 游艳芝1, 卜令习2, 李晓利1, 蒋建新1*

(1. 北京林业大学 材料科学与技术学院；林业生物质材料与能源教育部工程中心，北京 100083;2. 国网节能服务有限公司 北京生物质能源技术中心，北京 100053)

摘要：以预处理后的废纸脱墨浆为底物，纤维素酶和纤维二糖酶为水解酶，研究了不同预处理方法(包括Na2SO3、H2O2、HCl)对酶解得率的影响。结果表明：与原料相比， 3种预处理方法都不同程度地提高了纤维素含量，增加底物的比表面积，降低纤维素的结晶度，促进酶水解；其中， H2O2预处理后的废纸脱墨浆的酶解得率最高，为91.67 %，其次是亚硫酸钠预处理和盐酸预处理，得率分别为87.57 %和82.49 %。

关键词：废纸脱墨浆；预处理；酶水解；表面积；结晶度

为缓解全球环境污染及能源损耗问题，将一些废弃的生物质通过预处理、酶解糖化、微生物发酵等过程转化为能源及化学品具有重要的意义。其中，对废纸进行脱墨制浆后，所得废纸脱墨浆可以作为一种富含纤维素的生物质原料，经生物转化制备生物基燃料和化学品。由于废纸的组成比较复杂，不仅包括纤维素组分，还存在着纸浆中残余的木质素和半纤维素包围在纤维素微细纤维周围，对纤维素酶降解碳水化合物产生空间阻碍作用,影响纤维素的水解，降低纤维原料的酶解效率[1-3]。此外,纤维素的高结晶度也是导致其难以利用的重要因素。因此，为了使废纸脱墨浆酶解应用在经济上可行，为后续发酵提供足够碳源，降低生物质产品(乙醇、丁醇等液体燃料)的生产成本[4]，必须降低酶用量，获得高酶解得率，这就需要在纤维素酶解之前，对原料进行相应的预处理，除去部分半纤维素和木质素，增加纤维素的可及性。本研究探讨了废纸脱墨浆经过HCl、 Na2SO3和H2O2这3种方法预处理后，纸浆组分、比表面积和结晶度的变化以及对葡萄糖得率的影响。

1实 验

1.1材料与仪器

废纸脱墨浆，华泰造纸厂提供；纤维素酶(Celluclast,1.5 L，74 FPU/mL)和纤维二糖酶(Novozyme188，175 CBU/mL)，购于Sigma公司；HCl、Na2SO3以及H2O2，AR，国药集团。

Waters 2695e液相色谱仪，Waters 公司；XRD-6000 X射线衍射仪，日本Shimadzu；Tristar 3020Ⅱ 比表面积测定仪，美国Micromeritics。

1.2废纸脱墨浆的预处理

1.2.1Na2SO3预处理10 g(绝干)废纸脱墨浆加入到聚四氟乙烯制作的预处理反应器中，加入0.75 g NaOH和2 g Na2SO3，加入一定量的去离子水至100 mL混合均匀后密封，然后将预处理反应器转入不锈钢罐，并保持固定；均相反应器以5 ℃/min的升温速率达到140 ℃；2 h后，迅速用自来水将系统冷却；用去离子水将不溶性残渣洗涤至中性，并在105 ℃下烘箱中烘干至质量恒定。

1.2.2HCl预处理10 g(绝干)废纸脱墨浆,按固液比1∶10(g∶mL)的比例加入2 % HCl溶液润浸，于室温(30 ℃左右)，搅拌反应2 h；用去离子水将纸浆洗净，并在105 ℃下烘箱中烘干至质量恒定。

1.2.3H2O2预处理H2O2预处理参照纸浆漂白工艺[5]，取10 g(绝干)废纸脱墨浆置于烧杯中，加入100 mL去离子水，依次加入2 % H2O2、 1 % NaOH、 2 % Na2SO3、 0.05 % MgSO4和0.15 % EDTA， 70℃下搅拌反应1.5 h；用去离子水将纸浆洗净，并在105℃下烘箱中烘干至质量恒定。

1.3预处理后废纸脱墨浆的酶解

原料和预处理后的纸浆进行纤维素酶水解实验。分别称取3 g(绝干)废纸脱墨浆作底物于锥形瓶中，依次加入纤维素酶18 FPU/g(以纤维素质量计，下同)、纤维二糖酶27 CBU/g，最后加入pH值4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液至60 mL配成底物质量浓度0.05 g/L；将密封的锥形瓶置于48 ℃下的振动培养箱中以150 r/min反应96 h。在0、12、24、36、48、72、96 h处取样(2 mL)，先将样品在3 000 r/min的离心机中离心3 min，用0.22 μm滤膜过滤，收集滤液[6-7]，然后采用HPLC法测定各单糖浓度，计算酶解得率。

1.4分析及表征

1.4.1预处理前后废纸脱墨浆的组分分析按照美国可再生能源实验室的方法分析废纸脱墨浆中纤维素、半纤维素、木质素和灰分的含量[8]。 反应结束后，向水解液中加入84 mL去离子水将硫酸稀释到体积分数3 %。拧紧耐压瓶盖，然后将其置于121 ℃的高压灭菌锅中反应1 h。反应结束后，冷却至室温，取上清液通过HPLC测定样品中的糖类组分。用G3坩埚过滤得到的残渣为Klason木质素以及样品中的灰分，在105 ℃烘箱中烘干，测得其质量。最后将含有固体残渣的G3坩埚置于600 ℃马弗炉中煅烧6 h，冷却，称量，测定其中灰分含量。样品中的木质素含量为除去灰分后的固体质量[9]。

1.4.2底物表征(BET)采用氮气吸附BET原理测定不同预处理后纸浆的比表面积，由于废纸脱墨浆纤维素不易分离，所以测定前需要对其进行相应处理。取一定量纸浆于烧杯中，加入去离子水，用搅拌器将其分散，待完全分散后，加入丙酮，继续用搅拌器搅拌1 h，过滤，如此重复3次；将滤净的纤维撕成小片，放入恒温鼓风干燥箱中， 60 ℃下干燥8 h，脱掉水分和丙酮；利用疏解器分离纤维素，即可得到单根纤维间相互分离的纤维。用以上处理过的纤维进行氮气吸附测定比表面积，根据BET方程式，测出被测样品单分子层的吸附量，从而计算样品的比表面积。

1.4.3X射线衍射(XRD)Cu靶，石墨单色器，加速电压30 kV，电流20 mA，扫描步长0.5 °，扫描速度0.2 (°)/min，扫描范围(2θ)为5 °～60 °[10]。木质纤维物料的相对结晶度ICr(%)通过以下公式计算：

ICr=(I002-Iam)/I002×100 %

式中：I002—校正后结晶区强度， 2θ=22.5 °；Iam—校正后无定形区强度， 2θ=16.6 °。

2结果与讨论

2.1预处理对废纸脱墨浆组成、形貌及结晶度的影响

表 1　预处理对废纸脱墨浆主要组成的影响

2.1.2形貌研究发现，影响酶水解的因素有多种，包括木质素含量、比表面积、聚合度等，它们之间相互作用共同影响纤维素的可及性，其中，底物的比表面积对纤维素可及度起到关键作用，孔径以及孔容也会不同程度影响纤维素的可及度[10,12]。表2给出了原料及不同预处理后纸浆的比表面积、孔径和孔容。从表2可以看出，预处理后，废纸脱墨浆比表面积、孔径以及孔容均有所增加。其中Na2SO3处理的物料比表面积、孔容最大，孔径也有明显的增加。Na2SO3处理，脱除大量木质素，并伴随着部分半纤维素溶出，暴露出更多的纤维素，增加其比表面积，提高纤维素的可及度，促进酶水解[9]。HCl在低温下主要是通过部分水解半纤维素和木质素，使纤维表面膨胀和松动，增加其孔隙度。H2O2处理后，通过氧化降解木质素来打破网状结构，从而提高纤维素的可及度,增加纤维素与酶的接触面积,提高纤维素的转化效率。

表 2　不同预处理对底物比表面积、孔径、孔容的影响

2.1.3结晶度纤维素大分子是由D-吡喃式葡萄糖基以β-1,4苷键连接起来的链状高分子化合物，其大量羟基的存在使纤维素分子内和分子间存在着大量的氢键。氢键作用强的地方排列得比较整齐有规则，形成结晶区，氢键作用弱的地方是纤维素的无定形区[13]。纤维素酶首先作用于无定形区，水解速度快，然后再降解结晶区弱的区域，水解速度较慢。在此过程中，分子间的氢键网络的存在起关键作用。通过XRD可以测定纤维素的结晶度，从而探讨预处理对纤维素结构的影响。原浆及3种预处理后样品的XRD图谱如图1所示，原料与预处理样品的最强衍射峰均在22.5 °和16.3 °，为典型的纤维素图谱。经计算，原料以及Na2SO3、HCl和H2O2预处理的纸浆的结晶度分别为48.8 %、42.0 %、43.0 %和45.6 %。可以看出，经过3种预处理后，不仅可以去除部分半纤维素和木质素，同时可有效作用于纤维素的结晶区部分，使得无定形区相对增加，增大了纤维素的可及度，促进酶水解，提高葡萄糖得率。Na2SO3预处理过程中，加入的NaOH形成碱溶液，很容易进入纤维素分子之间，消除分子间的作用力，润胀原料，从而增加其内部表面积，降低结晶度[14]。利用HCl处理废纸脱墨浆，纤维素大分子的苷键对酸的稳定性很低，在温和条件下，发生水解降解，促使氢键断裂，扩大无定形区，效果仅次于Na2SO3预处理。同时水解半纤维素，疏松原料结构，使得纤维素酶可以更好的与纤维素接触，提高水解效率[15]。H2O2预处理过程中，部分纤维素受到氧化，促使氢键被氧化[16]，在碱性溶液中断裂，降低结晶度。但是由于H2O2主要与木质素作用，所以其效果稍逊于Na2SO3和HCl预处理。

2.2预处理对酶解得率的影响

3种不同预处理方式的废纸脱墨浆的酶水解葡萄糖得率随着水解时间逐渐增加，如图2所示。纤维素酶加入量18 FPU/g，纤维二糖酶加入量27 CBU/g，水解96 h后，经H2O2处理后的废纸脱墨浆葡萄糖得率最高，为91.67 %，其次是Na2SO3、HCl预处理后的纸浆，得率分别为87.57 %、82.49 %，与原浆(77.50 %)相比，均有所提高。这是因为经过H2O2处理，部分木质素的脱除，抑制了木质素对酶的无效吸附作用，从而提高液体中游离酶量以及纤维素的可及性。同时，预处理后增加了底物的比表面积，降低纤维素的结晶度，这些都有利于提高酶水解效率，另外，在H2O2预处理过程中加入了少量的EDTA，抑制了金属离子对酶活的抑制作用[17]，使酶水解得到改善，双重促进作用使得H2O2预处理后葡萄糖得率最高。Na2SO3预处理是在碱性环境中进行的，预处理过程中有木质素磺酸盐生成，有研究报道木质素磺酸盐对酶水解过程具有促进作用[18]，并且比表面积的扩大和结晶度的降低都有利于促进酶水解。而HCl预处理，H+浓度较低时作用于纤维素结构较松散的无定形区并导致纤维素分子链发生断裂,同时促进半纤维素的降解溶出[19]，更多的纤维素被暴露，从而增加了纤维素酶与纤维素接触的几率,促进了酶解作用,由此提高葡萄糖产量。

图 1不同预处理底物与原料的X射线衍射图

图 2不同预处理底物与原料葡萄糖得率

Fig. 1X-ray diffraction of deinking waste paper pulp with different pretreatments

Fig. 2Glucose yield of deinking waste paper pulp with different pretreatments

3结 论

3.1分别利用HCl、Na2SO3、H2O2对废纸脱墨浆进行预处理，对预处理前后浆的组成、结构进行分析，结果表明：经H2O2预处理后的纸浆中纤维素最高，达到61.60 %；Na2SO3预处理后纤维素的比表面积最大，为2.533 m2/g； 3种预处理浆的纤维结晶度均有所降低，其中Na2SO3和HCl效果最明显，分别为42.0 %和43.0 %。

3.2分别以3种预处理浆为水解底物，进行酶解产葡萄糖研究。结果表明：在底物质量浓度0.05 g/L，纤维素酶用量18 FPU/g(以纤维素计，下同)，纤维二糖酶用量27 CBU/g， 48 ℃的条件下酶水解96 h后，经H2O2预处理纸浆葡萄糖得率最高为91.67 %，相比原浆(77.50 %)提高了14.17个百分点，其次是Na2SO3处理(87.57 %)和 HCl预处理(82.49 %)。

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doi:10.3969/j.issn.1673-5854.2016.04.007

收稿日期：2016-03-01

基金项目：国家自然科学基金资助项目(31070510);科技部国际科技合作专项(2014DFG32550)

作者简介：杨淑娟(1991— )，女，山东临沂人，硕士生，主要从事废纸再利用研究工作 *通讯作者：蒋建新，教授，博士生导师，主要从事林产化工及生物质能源方面的研究；E-mail：jiangjx@bjfu.edu.cn。

中图分类号：TQ352

文献标识码：A

文章编号：1673-5854(2016)04-0037-05

Pretreatment of Waste Paper Pulp and Enzymatic Hydrolysis Properties

YANG Shu-juan1, YOU Yan-zhi1, BU Ling-xi2, LI Xiao-li1, JIANG Jian-xin1

(1. College of Material Science and Technology,MOE Engineering Research Center of Forestry Biomass Materials and Bioenergy,Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 2. Beijing Biomass Energy Technology Center,State Grid Energy Conservation Service Ltd., Beijing 100053, China)

Abstract:In order to study the effects of various pretreatments(Na2SO3,H2O2 and HCl) on enzymatic hydrolysis of deinking waste paper pulp,the hydrolyses were carried out with the pretreated pulp as substrate and cellulase and cellobiase as hydrolytic enzyme.It was concluded that three pretreatment methods could increase glucose yield by improving the content of cellulose,inceasing the specific area and disrupting its structure.Compared with the yield of raw pulp,the highest yield was achieved with the hydrolysis of hydrogen peroxide pretreated deinking waste paper pulp (91.67 %),closely followed by sodium sulfite (87.57 %) and dilute acid pretreatment (82.49 %).

Key words:deinking waste paper pulp;pretreatment;enzymatic hydrolysis;surface area;crystallinity

·研究报告——生物质材料·