TGF-β1 PDGF-BB及CTGF在慢性乙型肝炎患者肝组织中的表达及意义

郭　堑, 农村立

(广西医科大学第四附属医院 感染科, 广西 柳州, 545005)



TGF-β1PDGF-BB及CTGF在慢性乙型肝炎患者肝组织中的表达及意义

郭堑, 农村立

(广西医科大学第四附属医院 感染科, 广西 柳州, 545005)

摘要:目的探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者肝纤维化不同阶段转化生长因子-β1(TGF-β1)、血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)、结缔组织生长因子(CTGF)在肝组织中的表达及意义。方法根据慢性肝炎分期标准，将80例CHB患者分为S0组、S1组、S2组、S3组和S4组，观察各组肝组织TGF-β1、PDGF-BB、CTGF免疫组织化学染色；比较各组肝组织TGF-β1、PDGF-BB、CTGF含量，以及血清Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(CⅣ)、透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)水平，并分析TGF-β1、PDGF-BB、CTGF水平与血清肝纤维化相关指标的相关性。结果TGF-β1、PDGF-BB、CTGF免疫组化染色结果及水平比较表明，肝组织中TGF-β1、PDGF-BB、CTGF水平均与肝纤维化程度密切相关，且随肝纤维化程度的加重而增加。从S0组到S4组，血清PCⅢ、CⅣ、HA、LN水平依次递增，各组间比较差异均有统计学意义(P<0.01)。相关性分析结果表明，肝组织中TGF-β1、PDGF-BB、CTGF水平均与血清PCⅢ、CⅣ、HA、LN水平呈正相关(P<0.05)。结论在肝纤维化的不同阶段，肝组织中TGF-β1、PDGF-BB、CTGF表达水平随肝纤维化程度的加重而增加，在早期肝纤维化诊断方面具有重要价值。

关键词:转化生长因子-β1; 血小板源性生长因子; 结缔组织生长因子; 慢性乙型肝炎

肝纤维化是慢性乙型肝炎(CHB)发展为肝硬化的重要病理变化，主要表现为肝脏纤维结缔组织增生、细胞外基质(ECM)过度沉积等。目前普遍认为，肝纤维化的发生与肝星状细胞(HSC)激活过程密切相关[1-2]。HSC激活后，大量ECM被合成，基质金属蛋白酶(MMP)活性下降，MMP组织抑制因子合成增加，纤维基质降解减少，沉积增加。在肝纤维化启动、发展、肝硬化形成过程中，转化生长因子-β1(TGF-β1)发挥核心作用，且与HSC、实质细胞、纤维化相关生长因子及各种酶类具有相互作用[3]。血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)是作用于HSC的最重要促有丝分裂原。多种因素引起的肝损害均可导致肝脏多种细胞合成并释放PDGF-BB, 以促进HSC转化为肌样成纤维细胞，从而加速肝纤维化的发生与发展[4]。结缔组织生长因子(CTGF)主要来源于HSC，能够诱导成纤维细胞增殖，并促进其分泌ECM。研究[5]发现，机体CTGF表达上调可作为HSC活化的标志。本研究通过观察CHB肝纤维化不同阶段TGF-β1、PDGF-BB及CTGF在肝组织的表达水平，并探讨其与肝纤维化发生发展的关系，以期为临床评估肝纤维化提供更多的理论依据。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2012年4月—2015年4月广西医科大学第四附属医院收治的CHB患者80例，均行肝脏活体组织穿刺病理检查，排除标准: ① 酒精性肝病、脂肪肝；② 甲、丙、戊型肝炎或重叠感染; ③ 药物性肝病; ④ 自身免疫性肝病、肿瘤，以及其他器官组织纤维化。其中男42例，女38例；年龄19～50岁，平均(39.5±2.0)岁；病程30 d～15年。参考《病毒性肝炎防治方案》[6]中对慢性肝炎的分期标准，分为5组，即S0组15例、S1组16例、S2组17例、S3组17例、S4组15例。各组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05), 见表1。

表1　各组一般资料

1.2方法

1.2.1肝脏活体组织穿刺: 行肝脏活体组织穿刺前对血小板计数、凝血酶原时间、凝血酶原活动度等指标进行检测，以确定患者是否符合肝穿活检适应证。本研究入组80例患者均符合该适应证，在SoNoLiNEVerSA plus型彩色多普勒超声(德国西门子)引导下，用穿刺枪行肝脏组织穿刺术，取肝组织10×1 mm, 经10%福尔马林固定，送病理检查，进行炎症分级和纤维化分期。肝组织常规脱水，石蜡包埋，切片，行常规HE染色、Masson染色、网状纤维染色，水洗、封片后，经病理图像分析系统读片。

1.2.2肝功能与血清肝纤维化指标检测: 实验开始前，清晨空腹采集静脉血3 mL, 离心后取血清，行常规肝功能和乙型病毒性肝炎(HBV)-DNA检测。采用放射免疫分析法检测血清肝纤维化指标，包括血清Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(CⅣ)、透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)。检测试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司。

1.2.3TGF-β1、PDGF-BB、CTGF免疫组织化学染色: 石蜡切片后，经脱蜡、过氧化氢孵育、蒸馏水漂洗、抗原修复、滴加一抗和二抗、磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗、DAB显色等步骤，镜下观察染色结果。每张切片随机选取10个视野，采用美国IPP彩色图像分析软件测定每一视野中TGF-β1、PDGF-BB、CTGF的含量，取10个视野的平均值为本张切片的阳性染色含量。彩色图像分析软件测定单位为面密度。

1.3观察指标

比较各组肝组织TGF-β1、PDGF-BB、CTGF含量，以及血清PCⅢ、CⅣ、HA、LN水平；分析TGF-β1、PDGF-BB、CTGF与血清肝纤维化相关指标的相关性。

1.4统计学处理

2结果

2.1各组肝组织TGF-β1、PDGF-BB、CTGF免疫组化染色结果

肝组织TGF-β1免疫组化染色阳性显色为棕黄色, S0组未见阳性反应物质(图1A); S1、S2组阳性染色主要位于肝窦壁细胞、肝窦周细胞，着色较浅(图1B、1C); S3、S4组可见大量阳性染色物质，主要位于纤维间隔、肝细胞，着色较深(图1D、1E)。

肝组织PDGF-BB免疫组化阳性染色呈棕黄色, S0组未见阳性染色物质(图2A)；S1、S2组阳性染色物质主要分布于肝窦壁细胞、肝窦周细胞、肝间质细胞和肝细胞，染色较明显(图2B、2C); S3、S4组阳性染色主要分布于纤维间隔区域，染色最深(图2D、2E)。

肝组织CTGF免疫组化染色结果显示，阳性染色物质为棕黄色，S0组未见明显CTGF阳性染色物质(图3A)，S1、S2组可见CTGF阳性染色程度较浅，主要分布于纤维化区(图3B、3C); S3、S4组可见CTGF阳性染色程度较深，主要分布于纤维化区、HSC、成纤维细胞中(图3D、3E)。

2.2各组肝组织TGF-β1、PDGF-BB、CTGF含量比较

从S0组到S4组，TGF-β1、PDGF-BB、CTGF的面密度逐渐增加，各组间比较，差异均有统计学意义(P<0.01), 见表2。可见，肝脏TGF-β1、PDGF-BB、CTGF水平与其纤维化程度密切相关，随着肝纤维化程度的加重而表达增多。

注:1A:S0组;1B:S1组;1C:S2组;1D:S3组;1E:S4组图1 各组肝组织TGF-β1免疫组化染色

注:2A:S0组;2B:S1组;2C:S2组;2D:S3组;2E:S4组图2 各组肝组织PDGF-BB免疫组化染色

注:3A:S0组;3B:S1组;3C:S2组;3D:S3组;3E:S4组图3 各组肝组织CTGF免疫组化染色

表2　各组肝组织TGF-β1、PDGF-BB、CTGF含量比较　×10-2, g/m2

与S0组比较，**P<0.01; 与S1组比较, ##P<0.01; 与S2组比较, △△P<0.01; 与S3组比较, ▲▲P<0.01。

2.3各组血清PCⅢ、CⅣ、HA、LN水平比较

从S0组到S4组，血清PCⅢ、CⅣ、HA、LN水平依次递增，各组间比较，差异均有统计学意义(P<0.01), 见表3。可见, CHB患者血清PCⅢ、CⅣ、HA、LN水平与肝纤维化程度密切相关，随着肝纤维化程度的加重而增加。

表3　各组血清PCⅢ、CⅣ、HA、LN水平比较　μg/L

与S0组比较，**P<0.01; 与S1组比较, ##P<0.01; 与S2组比较, △△P<0.01; 与S3组比较, ▲▲P<0.01。

2.4TGF-β1、PDGF-BB、CTGF与血清肝纤维化指标的相关性

肝组织TGF-β1与血清PCⅢ、CⅣ、HA、LN水平呈正相关(P<0.05),r分别为0.684、0.756、0.740、0.732。肝组织PDGF-BB与血清PCⅢ、CⅣ、HA、LN水平呈正相关(P<0.05),r分别为0.681、0.692、0.785、0.720。肝组织CTGF与血清PCⅢ、CⅣ、HA、LN水平呈正相关(P<0.05),r分别为0.655、0.740、0.732、0.725。

3讨论

在关于肝纤维化发生机制及治疗靶点的研究中，细胞因子网络是学者研究的重点。研究[7]表明，TGF-β1、PDGF-BB、CTGF在肝纤维化过程中发挥重要作用。TGF-β1在肝脏中含量较高，与肝纤维化关系较密切[8]。肝损伤期间，ECM沉积和降解的动态平衡被打破, TGF-β1能够抑制ECM降解，并促进其合成，对肝细胞再生具有抑制作用[9]。TGF-β1通过与肝纤维化相关细胞因子及各种酶类相互作用而引发肝纤维化，在肝纤维化的启动、进展过程中发挥核心作用[10]。肝细胞外基质的主要产生细胞是HSC, TGF-β1能够激活静态的HSC, 转换其表型，使HSC膜上巨球蛋白受体表达增加，从而进一步增加TGF-β1的表达水平[11]; 同时，其还能增加ECM受体在HSC膜上的表达。研究[12]发现，肝病患者肝组织中TGF-β1表达水平显著高于健康人群，且TGF-β1升高程度与肝纤维化程度呈正相关。本研究结果也证实, CHB患者肝组织中TGF-β1水平与肝纤维化程度呈显著正相关, S0期未见明显TGF-β1阳性染色物质，S1、S2期仅在肝血窦周细胞、炎症坏死灶周围出现，表明在肝纤维化早期, TGF-β1主要来源于肝间质细胞; S4、S3期TGF-β1阳性表达主要分布于纤维间隔，表明肝纤维化发展至后期, TGF-β1主要来源于肝细胞。可见，在CHB纤维化发生过程中，各个分期均有TGF-β1表达，且其表达部位与纤维化发生部位一致，进一步说明TGF-β1促进了肝纤维化的形成。

PDGF-BB具有刺激特定细胞群分裂、增殖的能力[13]。体内主要由单核巨噬细胞分泌，当肝脏受伤时，巨噬细胞、血小板、炎症细胞、激活的HSC等均可分泌PDGF-BB。研究[14]证实，在纤维化过程中, PDGF-BB能够使处于静止期的G0细胞进入G1、S1期，从而进行DNA复制。本研究发现，PDGF-BB阳性染色主要位于细胞浆, S0期未见明显阳性染色, S1、S2期主要分布于肝窦壁细胞、肝细胞、间质细胞, S3、S4期主要表达于纤维间隔区，且着色较深。研究[15]发现，肝炎肝硬化患者PDGF-BB表达水平明显高于CHB患者，且随肝纤维化程度的加重而增加。本研究中，PDGF-BB表达水平从S0期到S4期逐渐升高，证实了PDGF-BB在促肝纤维化形成中发挥了重要作用。

CTGF通过诱导成纤维细胞的增殖和分泌ECM, 来参与细胞增生以及伤口愈合的过程[16]。其主要来源细胞是HSC, 同时HSC活化也需要CTGF表达上调等因素。有研究[17]表明，肝炎肝硬化患者CTGF表达水平明显高于CHB患者，肝纤维化程度越高，CTGF表达水平越高。可见CTGF在肝组织中的表达与肝纤维化严重程度密切相关。本研究发现，CTGF染色强度随肝纤维化程度的加重而增强。作为促纤维化因子, CTGF通过促进HSC增殖、活化来参与肝纤维化的发生与发展。相关性分析结果显示，肝组织中TGF-β1、PDGF-BB、CTGF水平与血清肝纤维化指标水平成正相关，说明TGF-β1、PDGF-BB、CTGF与肝纤维化指标的联合检测有助于诊断CHB的肝纤维化。

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收稿日期:2016-04-03

基金项目:中国高校医学期刊临床专项资金(11527743)

中图分类号:R 512.6

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2016)13-059-05

DOI:10.7619/jcmp.201613017

Expression and significance of TGF-β1,PDGF-BB and CTGF in the liver tissue of patients with chronic hepatitis B

GUO Qian, NONG Cunli

(1.DepartmentofInfectiousDiseases,FourthAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Liuzhou,Guangxi, 545005)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the expression and significance of transforming growth factor-β1(TGF-β1), platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) and connective tissue growth factor (CTGF) in the liver tissue of patients with chronic hepatitis B (CHB) at different stages of liver fibrosis.MethodsEighty patients with CHB were divided into groups S0, S1, S2, S3 and S4 according to chronic hepatitis staging standards.The immunohistochemical staining of TGF-β1, PDGF-BB and CTGF in the liver tissue was observed in each group.The contents of TGF-β1, PDGF-BB and CTGF in the liver tissue as well as levels of serum procollagen Ⅲ (PCⅢ), collagen Ⅳ (CⅣ), hyaluronic acid (HA) and laminin (LN) were all compared in each group, and the relationships between TGF-β1, PDGF-BB and CTGF levels and serum liver fibrosis-related indexes were also analyzed.ResultsThe immunohistochemical staining results of TGF-β1, PDGF-BB and CTGF and comparison of their levels revealed that the levels of TGF-β1, PDGF-BB and CTGF in the liver tissue were all associated with the degree of liver fibrosis, and increased with the degree of liver fibrosis exacerbation.The levels of serum PCⅢ, CⅣ, HA and LN gradually elevated from groups S0 to S4, and the differences were statistically significant among groups (P<0.01).Correlation analysis showed that the levels of TGF-β1, PDGF-BB and CTGF in the liver tissue were all positively correlated with levels of serum PCⅢ, CⅣ, HA and LN (P<0.05).ConclusionAt different stages of liver fibrosis, the levels of TGF-β1, PDGF-BB and CTGF in the liver tissue increase with the degree of liver fibrosis

exacerbation, which is of great importance in the early diagnosis of liver fibrosis.

KEYWORDS:transforming growth factor-β1; platelet-derived growth factor-BB; connective tissue growth factor; chronic hepatitis B