KLF4在宫颈癌生长及转移表达的研究*

河北北方学院附属第一医院(张家口 075000) 张玉虹　康燕华　孙喜斌



KLF4在宫颈癌生长及转移表达的研究*

河北北方学院附属第一医院(张家口 075000) 张玉虹康燕华孙喜斌

摘要目的：探讨Kruppel样因子(KLF4)在宫颈癌生长情况及对宫颈癌细胞转移表达能力的影响。方法：收集宫颈癌手术患者癌和癌旁组织样本，采用免疫印迹实验(Western blot)、免疫组织化学、定量PCR法对宫颈癌组织、正常宫颈组织以及宫颈原位癌组织样本中KLF4表达进行检查，并分析表达结果与病理特征的关系。结果：不同组织中KLF4阳性细胞率具有统计学差异，其中正常宫颈组织以及宫颈原位癌组织中阳性细胞率均为100%，宫颈癌组织中阳性细胞率为58.8%。与正常宫颈组织相比，宫颈癌以及宫颈原位癌组织强阳性细胞率明显偏低，且差异具有统计学意义(P<0.05)。宫颈癌组织中KLF4的mRNA以及蛋白的表达明显低于宫颈原位癌组织，且差异具有统计学意义(P<0.05)。KLF4随着分化程度的下降，蛋白表达阳性率也随之降低；而随着临床上分期的升高蛋白表达阳性率降低，但其间差异不具有统计学意义(P>0.05)。结论：KLF4因子可能为一种抑癌因子，抑制肝癌细胞的侵袭和迁移，有望成为宫颈癌未来诊断以及治疗的潜在靶标。

主题词宫颈肿瘤@Kruppel样因子肿瘤转移

宫颈癌为目前世界上女性恶性肿瘤之一，病死率在全球占68%～75%，位居女性恶性肿瘤病死率首位[1]。该类癌症的发生与发展过程极为复杂，涉及多种抑癌基因以及原癌基因的抑制与激活情况。Kruppel样因子4(KLF4)为近期发现的一种锌指转录因子，主要参与细胞分化、细胞凋亡以及具有调节细胞周期等功能[2]。目前临床上对于KLF4与癌症发生发展之间的关系尚未明确。有学者认为KLF4参与肿瘤迁徙，造成细胞增生以及发育异常，影响肿瘤的预后；但也有报道限制KLF4在癌细胞中有抑制癌症扩散的功能[3]。本研究检测了不同宫颈癌组织中KLF4的表达，并对KLF4对宫颈癌的生长以及转移的影响进行探讨，报道如下。

资料与方法

1一般资料收集2013年 11月至2015年 11月我院宫颈癌组织、正常宫颈组织以及宫颈原位癌组织样本分别为34例、30例以及26例。所有组织均经病理切片证实，其中34例宫颈癌组织均为鳞癌患者组织，患者年龄范围为 29～66岁，平均年龄41.6±4.6岁。按照分化程度分类，39例宫颈癌患者中有9 例高分化、15 例中分化以及10 例低分化。按照国际妇产科联盟的临床分期标准，39例宫颈癌患者中21 例I 期，7 例II期，5 例III期，1 例IV期。

2方法

2.1仪器与试剂：仪器：37℃恒温培养箱(上海天呈科技有限公司)；酶标仪(BMG， LABTECH POLARstar Omega)；自动生化分析仪 LX-21(美国 BECKMAN 公司)；台式高速度冷冻离心机(德国 ELRCRON 公司)；LightCycler®96 全自动荧光定量PCR系统(Roche公司, 96 通量)。

试剂：SP 染色试剂盒(上海基尔顿生物科技有限公司)；兔抗人 KLF4 多克隆抗体(美国 DSL公司)。二氨基联苯胺显色剂(南京化学试剂有限公司)；多聚赖氨酸(Sigma公司)。

2.2免疫组织化学:采用福尔马林固定、石蜡包埋的方法将收集的癌及癌旁组织制备成石蜡切片，按照标准操作流程[4]，先将切片脱蜡水化。采用柠檬酸钠(pH=6)溶液修复2min，双氧水30ml/L常温封闭10min，以破坏过氧化物酶的活性。采用PBS缓冲液洗涤三次后加入胚胎牛血清50mL/L封闭20min，随后依次采用兔抗人KLF4多克隆抗体、羊抗兔IgG在 37℃条件下分别孵育2h及30min，每次孵育后采用PBS缓冲溶液冲洗3次。最后采用辣根过氧化酶标记生物素染色，二氨基联苯胺液显色，苏木精复染后，脱水，透明，封片，显微镜观察各组织染色情况。根据最终细胞的染色强度以及显色比例对KLF4进行半定量分析。按照阳性细胞率以及显色程度值进行评价：阳性细胞数目>80%为4分，51%～80%为3分,11%～50%为2分；染色强为3分，染色中等为2分，染色弱为1分。当阳性细胞率低于10%时，无论染色强度高低均认为是阴性，用(-)表示；当评分值在3～5分时，为弱阳性，用(+)表示；当评分在6～7分时，为强阳性，用(++)表示。

2.3实时荧光定量PCR检测KLF4的mRNA的表达:使用Trizol试剂(Invitrogen公司生产)从宫颈癌组织以及宫颈原位癌组织中提取总RNA，随后将提取的RNA在20μL反应体系中逆转录为cDNA。采用LightCycler®96 全自动荧光定量PCR系统对各样本进行分析，每个样本重复测定3次，测定具体条件为：94℃条件下反应15min，60℃一集72℃各反应30s，最终经历40个循环。测定循环阈值由仪器的荧光预设点为限。

2.4Western blot检测KLF4蛋白的表达情况:将收集的宫颈癌组织以及宫颈原位癌组织中的组织蛋白采用蛋白裂解液法进行提取，并通过Western blot法检测其中的KLF4的表达情况。

3统计学方法应用 SPSS19. 0 统计软件，计量数据采用均值±标准差表示，两组间的比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。计数数据采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1免疫组织化学检测KLF4在宫颈癌中的表达情况由于检测的KLF4存在于细胞核内，因此本次研究中所显示的检测结果中组织细胞的细胞核为棕黄色，且分布模式多为弥漫性分布，少见点状或灶状分布。在正常宫颈组织以及原位癌组织中可见阴性细胞，且染色强度由下到上呈现增强趋势。对比不同组织中KLF4阳性细胞率发现，正常宫颈组织以及宫颈原位癌组织中阳性细胞率均为100%，宫颈癌组织中阳性细胞率为58.8%，与正常宫颈组相比，阳性率显著下降，且差异具有统计学意义(P<0 .05)。与正常宫颈组织相比，宫颈原位癌组织中呈现强阳性的数目明显偏低，且差异具有统计学意义(P<0 .05)。具体结果见表1。

表1　免疫组织化学检测KLF4在宫颈癌中的表达情况

注：与正常组织相比，*P<0 .05

2KLF4的mRNA及蛋白在宫颈癌以及宫颈原位癌组织中的表达采用实时荧光定量PCR对宫颈癌组织以及宫颈原位癌组织中KLF4的mRNA表达情况进行检测，结果显示宫颈癌组织中KLF4的mRNA表达明显低于宫颈原位癌组织，且差异具有统计学意义(P<0.05)。采用Western blot检测宫颈癌组织以及宫颈原位癌组织中KLF4蛋白的表达情况，发现在宫颈癌组织中KLF4蛋白的表达明显低于宫颈原位癌组织，且差异具有统计学意义(P<0.05)。

3宫颈癌组织中 K LF4 蛋白表达水平与临床病理参数的关系KLF4 在不同临床病理分级组织中表达不同，随着分化程度的下降，蛋白表达阳性率也随之降低；此外，该蛋白表达阳性率随着临床上分期的升高而降低，但其间差异不具有统计学意义(P>0.05)，具体结果见表2。

表2　宫颈癌组织中KLF4 蛋白表达水平与临床病理参数的关系

讨论

KLF4基因据报道定位于染色体9q31上，是一种近期新发现的KLF家族转录因子，主要由470个氨基酸构成的蛋白质编码形成。KLF4主要分布于人体皮肤、胃肠道、血管内皮细胞等处，参与多种细胞生命活动，包括细胞分化、细胞周期、细胞凋亡等。目前KLF4与癌症的关系尚未有明确解释。有报道显示， KLF4 通过下调细胞增生分化过程中基因表达、参与调节细胞周期以及细胞凋亡而发挥着抑制癌细胞扩散与增长的作用[5]。

本研究采用免疫组织化学法、定量PCR法以及Western blot法对不同宫颈组织中KLF4的表达进行研究，结果发现，宫颈癌组织中阳性细胞率为58.8%，明显低于正常宫颈组织以及宫颈原位癌组织中阳性细胞率(100%)，且差异具有统计学意义。而KLF4在宫颈癌组织中的mRNA以及蛋白的表达也明显低于宫颈原位癌组织，且差异具有统计学意义。说明KLF4基因表达的下调可能伴随着肿瘤的生长。有报道显示，将MCF-1OA细胞中的KLF4基因进行敲除后，乳腺永生化细胞株的上皮细胞形态有所改变，且细胞的迁移能力有所增加[6]；而过表达KLF4因子后，MDA-MB-231细胞中与细胞迁移以及细胞侵袭功能有关的E-cadherin因子表达上调，细胞的迁移以及侵袭能力显著下降。还有报道显示， KLF4 的表达能够抑制细胞生长以及细胞 DNA的合成，证实了KLF4 可能为一种抑癌基因[7]。

研究中还发现KLF4 在不同临床病理分级组织中表达不同，随着分化程度的下降，蛋白表达阳性率也随之降低；此外，该蛋白表达阳性率随着临床上分期的升高而降低，但其间差异不具有统计学意义。说明KLF4可能影响肿瘤的转移，当KLF4水平较低时，宫颈癌细胞转移能力较强，临床上分期升高；经过文献查阅，认为原因可能是KLF4 参与细胞增殖，影响并阻断细胞周期 G1/S 期。有报道显示， KLF4 在 P53 通路中具有活化 P21 的作用，进而能够保持细胞周期停止在G1/S 期而发挥抑制细胞增殖的作用[8]。此外，有研究证实，KLF4可以通过下调基质金属蛋白酶(MMPs)的表达，发挥抑制肿瘤迁移以及侵袭的作用。由于MMPs蛋白参与新生血管形成的某些金属离子以及肿瘤的转移、生长以及侵袭等过程，通过降解血管基底膜以及其他细胞外基质(ECM)，进而降解肿瘤细胞中血管基底膜以及突破细胞外基质中的蛋白，抑制肿瘤细胞的生长与迁移。高兴强等[9]发现，采用高表达的KLF4胰腺癌细胞注射给予小鼠后，癌细胞的转移能力受到明显抑制，进一步说明KLF4具有抑制肿瘤细胞转移的作用。

综上所述，KLF4与宫颈癌的发生、发展关系密切，其在人体内的表达缺失或许是宫颈癌早期癌变的预兆，有望成为宫颈癌未来诊断以及治疗的潜在靶标。通过上调KLF4在宫颈癌组织中的表达可能可以抑制肿瘤细胞的增殖以及迁移，进而降低肿瘤扩散程度，有望为疾病的治疗提供新思路。

参考文献

[1]宋晖,魏莉,李佳.KLF4在宫颈癌中的表达与临床意义[J].现代肿瘤医学，2015,23(01): 109-111.

[2]杨文婷,刘树艳,郑鹏生.转录因子KLF4在宫颈癌中的表达及意义[J].西安交通大学学报(医学版),2010,31(01): 22-25

[3]李萱,刘颖群,方兆武.P16、Ki67和cyclinD1在宫颈癌中的表达及TCT与HPV-DNA检查在宫颈癌早期诊断中的研究[J].中国妇幼保健,2016,31(04): 829-831.

[4]张媛. Ki-67、P-gp在宫颈癌新辅助化疗前后的表达及临床意义[D].蚌埠医学院，2015.

[5]陈娜,郜红艺,吴坤河. Kin17在宫颈癌中的表达及意义[J].热带医学杂志,2016,16(01):25-27.

[6]戴小芳,王芝芝,王媛,等.结直肠腺癌KLF4和BIRC7表达及其临床病理意义[J].中国现代医学杂志, 2015,25(13):35-39.

[7]杨莹莹,潘景,孙春意. hTERC基因表达及其和HPV感染在宫颈病变中的关系[J].中国妇幼保健,2015,30(16):2654-2656.

[8]Medlin EE, Kushner DM, Barroilhet L.Robotic surgery for early stage cervical cancer: Evolution and current trends[J].Surg Oncol, 2015, 112(7):772-781.

[9]高兴强,陈立波,谭俊.Kruppel样因子4在创伤新生血管内皮细胞中的表达和对血管内皮细胞功能的影响[J].中华实验外科杂志, 2013, 30(05):891-893.

(收稿：2016-04-09)

【中图分类号】R737.33

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.08.004

*河北省医学科学研究重点课题计划(20160376)