CDX2基因甲基化状态在结直肠锯齿状病变中的研究进展

2016-08-09李朝辉韩保卫王云帅郑州大学附属洛阳中心医院河南洛阳471000

系统医学 2016年6期

李朝辉，韩保卫，王云帅郑州大学附属洛阳中心医院，河南洛阳　471000

李朝辉，韩保卫，王云帅
郑州大学附属洛阳中心医院，河南洛阳471000

目的观察分析CDX2基因甲基化状态在结直肠锯齿状病变中的状态。方法选取该院在2011年3月—2015年7月期间收治的450例结直肠锯齿状病变患者（136例TSA，122例SSA/P，192例HP），并选取82例正常组织作为对照组，采用METHYLIGHT方法分析结直肠锯齿轮病变中CDX2基因甲基化状态，并采用免疫分析法分析CDX2基因的表达情况，收集相关的临床资料，分析CDX2基因甲基化状态在结直肠锯齿状病变中的状态和相关因素情况。结果正常对照组CDX2基因甲基化率53.38%（44/84），SSA/P组75.41%（92/122），HP组72.97% （140/192），TSA组80.88%（110/136）；HP组与正常对照组相比，差异有统计学意义（P=0.009）；TSA组与与正常对照组相比，差异有统计学意义（P=0.005）；SSA/P组与正常对照组相比，差异有统计学意义（P=0.002）。结论结直肠锯齿状病变中CDX2基因启动子CpG岛中上游区域基化程度高，蛋白表达阳性率高，两者相关性不强，极少部分甲基化状态有可能有诱导CDX2蛋白表达下调的作用。

CDX2基因；甲基化状态；结直肠；锯齿状病变

［Abstract］Objective To observe the analysis of CDX2 methylation state in colorectal serrated lesions.Methods A total of our hospital in March 2011 during July 2015 from 450 cases of colorectal serrated lesions（136 cases of TSA，122 cases SSA/P，192 cases of HP），and select 82 cases of normal tissues as control group，by METHYLIGHT method analysis of colorectal saw gear changes in the methylation status of CDX2 gene，and the use of immune analysis method to analyze the expression of CDX2 gene，collected the clinical data，analysis of CDX2 gene A Methylation status in colorectal serrated lesions status and relevant factors.Results The normal control group of CDX2 gene methylation rate 53.38%44/84，SSA/P group 75.41%92/122，HP group 72.97%（140/192），TSA group 80.88%（110/136）；HP group and normal control group compared，difference not obvious，does not have statistical significance（P=0.019）.The TSA group and compared with normal control group，the difference is not obvious，does not have statistical significance（P= 0.015）；group SSA/P and normal In the control group compared to the difference has statistical significance（P=0.002）. Conclusion Colorectal serrated lesions CDX2 gene start promoter CpG island in the upstream region based level is high，the protein expression positive rate is high，the correlation is not strong，very small part of the methylation status may have induced down-regulation of CDX2 protein expression，most of the methyl of may along with the age increased.

［Key words］CDX2 gene；Methylation status；Colorectal；Serrated lesions

在全球范围内，结直肠癌是临床常见的一种恶性肿瘤［1］，据临床数据统计，每年结直肠癌死亡人数占全部恶性肿瘤的8%，直接威胁到人类的健康与生命安全［2］。2010世界卫生组织对结直肠癌病变进行了更为详细的分类，包括增生性息肉（HP），占所有病变的75%以上，广基锯齿状腺瘤/息肉（SSA/P）占锯齿状病变的15%～25%［3］，而传统型锯齿状腺瘤（TSA）并不常见，占锯齿状病变的1%左右［4］。到目前为止，临床上关于结直肠癌的发病机制尚未明完全明了，但是关于这些基因的甲基化、基因杂合子丢失等异常改变使得锯齿状病变的发生发展却取得一定的发展，并为结直肠癌的靶向治疗提供了有效参考［5］。为此，以该院2011年3月—2015年7月期间收治的450例结直肠锯齿状病变患者作为研究对象，取得了不错的效果，具体报道结果如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

选取我院在2011年3月—2015年7月期间收治的450例结直肠锯齿状病变患者，男240例，女210例，年龄28～59岁，平均年龄（39.6±5.1）岁；其中，136例TSA，男78例，女78例，年龄28～59岁，平均年龄（39.8±4.9）岁；122例SSA/P，男62例，女60例，年龄28～59岁，平均年龄（39.7±5.5）岁；192例HP，男100例，女92例，年龄28～59岁，平均年龄（39.6±5.1）岁；并选取82例正常组织作为对照组，男42例，女40例，年龄28～59岁，平均年龄（39.2±5.3）岁；各组之间临床资料基数对比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2纳入标准

该研究所有患者均经过直肠息肉和腺瘤切睡筛选出腺体具有锯齿状特征的息肉及腺瘤，所有患者均进行组织学诊断和分类；均由3名病理医师按照WHO消化系统肿瘤分类标准及文献标准确诊。

1.3方法

回顾分析450例结直肠锯齿状病变患者（136例TSA，122例SSA/P，192例HP）的临床资料，并选取82例正常组织作为对照组，提取研究对象组织DNA，进行亚硫酸氢钠修饰，采用METHYLIGHT方法（TAQMAN探针）分析结直肠锯齿轮病变中CDX2基因甲基化状态，并采用免疫分析法分析CDX2基因的表达情况，收集相关的临床资料，分析CDX2基因甲基化状态在结直肠锯齿状病变中的状态和相关因素情况。

1.3.1实验仪器和试剂离心机（ANDYBIO）、生物安全柜、电热恒温水浴锅（DK-S24）、荧光定量PCR、超微量分光光度计（NANODROP）、涡旋震荡器（XW-80A）、显微照相镜（OLYMPUSBX40）、SC202-00型70度热恒温干燥箱、载玻片和盖玻片等。CDX2抗体（克隆号CDX-88）、DBA显色试剂盒。

1.3.2实验方法按照DNA提取试剂盒的操作步骤，将蜡块切成厚切片，连切5张，放入装有1 mL二甲苯的EP管中，剧烈震荡，离心分离，将不清液移除，重复4次，加入1 mL酒精，浓度100%，震荡摇匀，室温下离心分离，将管口打开，待残留的酒精全部蒸发，然后加入缓冲液、蛋白酶K、涡旋混匀，直到样品完全溶解，孵育1 h。然后再离心分离，提取所需要的DNA，将DNA样品置于零下20°的冰箱中保存。测量DNA纯度，用亚酸氢钠修饰，测序、免疫组织化学染色，判定结果。

1.4统计方法

采用SPSS 18.0统计软件进行χ2检验，计量资料用均数±标准差（±s）表示，并采用t检验，计数资料采用百分率（%）表示，采用χ2检验，以P＜0.05视为差异具有统计学意义。

2　结果

正常对照组CDX2基因甲基化率53.38%（44/ 84），SSA/P组 75.41%（92/122），HP组 72.97%（140/ 192），TSA组80.88%（110/136）；HP组与正常对照组相比，差异有统计学意义（P=0.009）；TSA组与与正常对照组相比，差异有统计学意义（P=0.005）；SSA/P组与正常对照组相比，差异有统计学意义（P=0.002）。

表1　正常对照组和SSAP组CDX2基因甲基化率比较（%）

表2　正常对照组和HP组CDX2基因甲基化率比较（%）

表3　正常对照组和TSA组CDX2基因甲基化率比较（%）

3　讨论

结直肠癌是常见的消化系恶性肿瘤［6］。近年来研究表明，结直肠的发病率呈现不断上升的趋势，主要原因就是人们缺乏对直肠癌锯齿病变的认识［7］。世界卫生组织（WHO）对消化系统肿瘤在2010年也进行了一些修正，但是并没有关于HP的明显变化，而是对TSA进行了严格的界定［8］。最近越来越多研究证明，锯齿状病变的恶变潜能高于传统的息肉/腺瘤。

据临床数据统计，每年结直肠癌死亡人数占全部恶性肿瘤的8%，直接威胁到人类的健康与生命安全。2010世界卫生组织对结直肠癌病变进行了更为详细的分类，包括增生性息肉占所有病变的75%以上，广基锯齿状腺瘤/息肉，占锯齿状病变的，而传统型锯齿状腺瘤并不常见，占锯齿状病变的1%左右。

有研究表明，锯齿状病变发生和恶变的过程是一个连续多阶段、多因素、多基因改变的渐进性和错综复杂的累积过程［9］。在锯齿状病变演变过程中，涉及多种癌基因，这些基因的改变，也导致锯齿状病变的特殊结构［10］，同时，基因表达在发生着可遗传性的变化，如染色体重塑、DNA甲基化等［11］，其中，DNA甲基化修饰异常与肿瘤发生关系密切，其会导致癌基因沉默，使病变迅速发展为癌［12］，因此，若能及时发现锯齿状通路中的异常的DNA甲基化，就可以获取结直肠癌的早期诊断和高发风险的标记物［13］。如在本次研究中，其结果显示:正常对照组CDX2基因甲基化率53.38%（44/84），SSA/P组 75.41%（92/122），HP组72.97%（140/192），TSA组80.88%（110/136）；HP组与正常对照组相比，差异有统计学意义（P=0.009）；TSA组与与正常对照组相比，差异有统计学意义（P= 0.005）；SSA/P组与正常对照组相比，差异有统计学意义（P=0.002）；说明从HP到SSA的演变过程中，通过DNA甲基化来确诊锯齿状病变的息肉-腺瘤进展，运用CPG和MSP检测的17个基因以及引物，发现不伴有异型增生的SSA检测到CDX2甲基化，但是HP没有检测到上述基因甲基化，且在研究中发现，CPG岛甲基化还可能是一个早期事件，通过CDX2基因的甲基化检测能够为准确检测直肠锯齿状病变发生癌变提供有效指导。这也与一些文献资料研究结果一致［14-15］。

总而言之，到目前为止，临床上关于结直肠癌的发病机制尚未明完全明了，但是关于这些基因的甲基化、基因杂合子丢失等异常改变使得锯齿状病变的发生发展却取得一定的发展，并为结直肠癌的靶向治疗提供了有效参考。结直肠锯齿状病变中CDX2基因启动子CpG岛中上游区域基化程度高，蛋白表达阳性率高，两者相关性不强，极少部分甲基化状态有可能有诱导CDX2蛋白表达下调的作用。CDX2基因甲基化的检测为结直肠锯齿状病变的早期诊断提供了用的生物学标志，对于结直肠锯齿状癌前病变的早期诊断有一定的临床价值和指导意义。

［1］张玉萍，王鲁平，方园.结直肠SSA/P和TSA的临床病理学及免疫组化研究［J］.诊断病理学杂志，2013，3（14）∶150-156.

［2］方园，王鲁平，张玉萍.结直肠锯齿状息肉的临床病理及7种抗体表达［J］.诊断病理学杂志，2013，4（17）∶212-217. ［3］葛畅，王鲁平，许春伟.结直肠锯齿状病变与p16基因甲基化的研究进展［J］.诊断病理学杂志，2013，5（19）∶310-312.

［4］黄文亭，郭蕾，郑波，等.结直肠锯齿状病变的形态学与免疫表型特征及其癌变风险研究［J］.中国肿瘤临床与康复，2013，6（17）∶549-553，673.

［5］许春伟，王鲁平，葛畅.CDX2基因甲基化在结直肠锯齿状病变中的研究进展［J］.诊断病理学杂志，2013，6（15）∶370-373.

［6］张玉萍，王鲁平，方园，等.锯齿状病变组织中Runx3基因的甲基化及蛋白表达［J］.基础医学与临床，2014，3（16）∶339-344.

［7］许春伟，王鲁平，葛畅.MGMT基因甲基化状态在结直肠锯齿状病变中的表达及意义［J］.中国医药导报，2014，2 （1）∶11-16，169.

［8］葛畅，王鲁平，许春伟，等.结直肠锯齿状病变中p16基因甲基化状态和蛋白表达的研究［J］.诊断病理学杂志，2014，3（13）∶169-174.

［9］许春伟，葛畅，王鲁平，等.5'-Aza-CdR对HT-29和LoVo结直肠癌细胞株中CDX2基因甲基化状态、mRNA表达及蛋白表达的影响［J］.世界华人消化杂志，2014，10 （22）∶1423-1430.

［10］葛畅，王鲁平，许春伟.结直肠锯齿状病变h-MLH1基因甲基化状态和蛋白表达意义研究［J］.中华肿瘤防治杂志，2014，21（13）∶1022-1027.

［11］许春伟，王鲁平，葛畅，等.锯齿状病变患者组织中CDX2基因启动子中上游区域的甲基化［J］.世界华人消化杂志，2013，33（25）∶3661-3669.

［12］许春伟，葛畅，王鲁平.结直肠锯齿状病变中基因启动子异常DNA甲基化状态的研究现状［J］.中华临床医师杂志:电子版，2013，12（28）∶5537-5540.

［13］方园，王鲁平.结直肠癌中相关基因甲基化改变的研究进展［J］.临床与实验病理学杂志，2012，7（17）∶792-794.