淫羊藿苷对高糖培养条件下大鼠颌骨骨髓基质细胞成骨能力的影响

李春梅，王馨，周立群，康立勋，李海清，马晟利.黑龙江省医院口腔科，黑龙江哈尔滨　5000；.黑龙江省医院产科，黑龙江哈尔滨　5000

淫羊藿苷对高糖培养条件下大鼠颌骨骨髓基质细胞成骨能力的影响

李春梅1，王馨1，周立群2，康立勋1，李海清1，马晟利1
1.黑龙江省医院口腔科，黑龙江哈尔滨150001；2.黑龙江省医院产科，黑龙江哈尔滨150001

目的探讨淫羊藿苷对高糖培养条件下大鼠颌骨骨髓基质细胞成骨能力的影响。方法选取2015年6月—2016年4月黑龙江省医院实验室的8只大鼠，实验分组（每个基因进行5个复孔平行实验）:正常组（2%胎牛血清+DMEM培养的细胞），高糖组（2%胎牛血清+高糖-DMEM培养的细胞），淫羊藿苷组1（2%胎牛血清+DMEM+淫羊藿苷培养的细胞），淫羊藿苷组2（2%胎牛血清+高糖-DMEM+淫羊藿苷培养的细胞），每组进行5个复孔平行实验。荧光定量测定成骨相关基因BMP2、OPN、BSP基因的表达。结果淫羊藿苷组1（1.78±0.10）与其它组比较:BMP2（1.37±0.04）、OPN（1.38±0.09）、BSP（1.50±0.05）基因的表达均高于其相应的对照组（P＜0.05）。结论淫羊藿苷对高糖培养条件下大鼠颌骨骨髓基质细胞成骨能力有加强作用。

淫羊藿苷；高糖；骨髓基质细胞

［Abstract］Objective To investigate the effect of the content of the bone marrow stromal cells in the bone marrow stromal cells induced by high glucose in rats under high concentration of glucose.Methods Selected June 2015-2016 in April in Heilongjiang Province Hospital Laboratory of 8 rats，experimental groups（each gene of five hole complex parallel experiment）∶normal group（2%FBS DMEM culture cells），high glucose group（2%fetal bovine serum+glucose of both cultured cells），icariin group 1（2%fetal bovine serum DMEM+icariin cultured cells）and icariin group 2（2%fetal bovine serum and high glucose increased+icariin cultured cells），every five holes in parallel experiments.The expression of BMP2，OPN and BSP genes in the bone related genes was determined by fluorescence quantitative.Results Compared with other groups，the expression of BMP2（1.37±0.04），OPN（1.38±0.09）and BSP（1.50±0.05）genes in the group of 1（1.78±0.10）and other groups was higher than that in the control group（P＜0.05）.Conclusion The effect of the content of the bone marrow stromal cells in the bone marrow stromal cells of rats under high glucose condition was enhanced by the high concentration of glucose in the rat bone marrow stromal cells.

［Key words］Icariin；High glucose；Bone marrow stromal cells

当人类社会日益发展并逐渐趋向老龄化时，人类患糖尿病的几率也日渐呈上升趋势，而该疾病会导致多种并发症，进而对患者健康造成极大影响。在由糖尿病引发的各种并发症中，骨质疏松是其较为常见的，且属于一种慢性疾病，因此会让患者长时间承受病痛，也会造成相关的功能障碍，而且还有致残的可能，且几率要比其它很多相关疾病都高［1］。糖尿病引起的骨质疏松近年来日益受到医学界的重视。淫羊藿苷（Herba epimedii）是一种传统的补益中药，其性味辛、甘、温。体现出强筋骨，补肾阳，祛风湿等各方面的作用。在临床上被广泛用于骨折、骨代谢相关的多种疾病的治疗中，已取得了显著的疗效［2］。骨形成蛋白2 （BMP2）在骨骼系统的早期发育过程中有着广泛的参与，无论是牙胚、心脑等关键脏器的形成，还是附件骨等的发育，都有着起到了重要的影响作用［3］。对成骨细胞的黏附过程和矿化的结束过程起着重要作用的就是骨桥蛋白（OPN）。骨涎蛋白（BSP）在骨矿化中扮演重要的角色，这主要是由它的时空特点体现的，因为它的表达主要在矿化组织［4］。

该课题通过探讨淫羊藿苷在高糖培养环境下，于2015年6月—2016年4月在黑龙江省医院实验室8只大鼠颌骨骨髓基质细胞成骨能力的影响，为淫羊藿苷治疗糖尿病引起的骨病提供理论基础并开辟新的思路。

1　实验材料与方法

1.1材料及设备

1.1.1材料 取100 g左右3个月健康雄性SD大鼠（黑龙江省医院动物饲养室提供）8只，颈椎脱臼处死。传三代培养，获得颌骨骨髓基质细胞［4］。

1.1.2试剂Super M-MLV反转录酶（20151221，0.5 mmol/L，武汉），高纯总RNA快速提取试剂盒（2015 1221，0.5 mmol/L，武汉），RNase固相清除剂（20152123，0.01mmol/L，武汉）Powder琼脂糖（20154211，0.6mmol/L，武汉）50×TAE2×Power Taq PCR MasterMix（201519876，0.5 mmol/L，武汉）。

1.1.3仪器超速冷冻离心机（湖南湘仪，K1000），微量移液器（BIOHIT，s120），真空干燥箱（SYSBERY，100），紫外分光光度计（Thermo，p900），荧光定量PCR仪（BION EER，TR232）

1.2实验方法

1.2.1实验分组正常组（2%胎牛血清+DMEM培养的细胞），高糖组（2%胎牛血清+高糖-DMEM培养的细胞），淫羊藿苷组1（2%胎牛血清+DMEM+淫羊藿苷培养的细胞），淫羊藿苷组2（2%胎牛血清+高糖-DMEM+淫羊藿苷培养的细胞）每组进行5个复孔平行实验。

1.2.2总RNA提取 反转录得到cDNA。

1.2.3实时荧光定量分析 反应体系如下。

cDNA模板1 μL

上下游引物（10 μM）各0.5 μL

SYBR GREEN mastermix10 μL

用ddH2O补足至20 μL

反应条件如下。

该实验利用韩国BIONEER公司生产的ExicyclerTM 96荧光定量仪进行荧光定量分析。

1.2.4分析方法 RNA提取:按照实验方法中的步骤进行RNA提取，并利用紫外分光光度计对提取的RNA浓度进行测定。RNA浓度见样本信息表。实时荧光定量分析如下。

①分析方法∶本实验分析方法利用2-△△CT方法。

②结果∶荧光定量分析仪得到的数据见附表（本实验每种样本每个基因进行5个复孔平行实验，实验数据的选取，是舍去误差较大的数值，取剩余数值的平均值作为最终实验保留数据）。利用2-△△CT方法分析数据见附表。

③统计分析方法:选用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。采取的数值格式为（Mean±SD），以正常组为参照组数值为1，以上数据统计均经SPSS 13.0软件统计完成，采取3次独立实验的单因素方差分析（*表示 P＜0.05，**表示 P＜0.01，***表示 P＜0.001）。

2　结果

2.1荧光定量检测实验测定结果

BMP2荧光定量结果见图1，OPN荧光宣结果见图2，BSP荧光宣结果见图3。

图1　BMP2荧光定量结果

图2　OPN荧光定量结果

图3　BSP荧光定量结果

荧光定量结果显示，淫羊藿苷组1BMP2、OPN和BSP基因表达明显高于其它组，淫羊藿苷组2基因表达高于高糖组和正常组，说明，淫羊藿苷增强高糖环境下颌骨BMCs的成骨能力。

3　讨论

糖尿病可引发骨代谢异常，进而导致多种糖尿病骨病（比如，骨量下降、骨折率上升等）。如上文所述，口腔骨丢失会对患者产生两种重要影响，其一为牙齿存留，其二为义齿修复。此外，糖尿病可引发牙槽骨丧失，还会导致粘膜损伤，所以患者往往都对修复治疗无法忍受［5］。当糖尿病患者人数逐渐上升，而相关医疗水平也日益提升时，糖尿病治疗亦日趋复杂化。近年来的相关研究表明，糖尿病与牙周病二者之间存在一种双向调节关系。根据大量科学数据可知，当人发生急性感染后，其内分泌状态以及其代谢状态都会发生变化，因此血糖控制很差，所以牙周感染会对糖尿病患者造成影响，使其无法很好地控制血糖［6］。有鉴于此，糖尿病治疗应注重牙周病的防治，否则可增加治疗难度。但在现实生活中，口腔医生对于糖尿病所引发的口腔并发症往往是较为忽视的。此外，对于糖尿病患者而言，维护口腔健康是一件十分重要的事情，假如牙科医生不能充分重视这一点，那么口腔健康也无法得到保障［7］。不过，对糖尿病患者口腔疾病的诊疗维护需要有足够的糖尿病知识作后盾，而口腔科医生在这方面最为欠缺，这些都是亟待解决的。

淫羊藿苷是中医治疗骨质疏松症最常用的药物之一，大量临床治疗证明了该药物的效果。作为淫羊藿的精华部分，淫羊藿苷在近年来被广泛的应用于成骨、破骨细胞的干预研究中［8］。现有的研究成果显示，淫羊藿苷在临床应用过程中能够有效的促进成骨细胞的发育和增殖。淫羊藿是一种药用植物，可归入小檗科淫羊藿属的范畴，是我国医学常用的传统补益中药［9］。根据《本草纲目》可知，这一味中药有多种功效，比如祛湿补肾、强心益精、强筋健骨，等等。在临床上，这味中药常用于骨折治疗，以及多种骨代谢相关疾病的治疗，且具有很不错的疗效。通过相关研究结果可知，这味中药具有诸多药理活性，包括提高免疫力、抑制癌症细胞、调节内分泌、提高性腺功能、延缓机体衰老进程、以及对心血管系统产生有益影响等等。这味中药之所以具有如此重要的药用价值，都归功于其有效活性成分，也就是一种黄酮类化合物——淫羊藿苷。这种物质是一种结晶粉末，外观呈淡黄色针状，很难在水中溶解，但却能在乙醇中溶解，也能在乙酸乙酯中溶解［10］。

该实验研究表明，高糖可以导致大鼠BMCs成骨相关基因表达下降（包括BMP2，BSP，OPN）由于成骨相关基因表达和ALP活性是成骨细胞早期分化标记，细胞钙结节形成是成骨细胞晚期分化标记，所有实验结果说明高糖抑制了BMCs向成骨细胞的早期和晚期分化，当在高糖环境下加入淫羊藿苷后，相关基因表达增强（包括BMP2，BSP，OPN），与马晓妮等人对成骨细胞的分化研究结果一致［11］。

BMP2，OPN，BSP和Runx2作为成骨能力评定指标，一般在BMCs向成骨细胞分化的过程中，伴随着全部或者部分的表达升高［12］。通常的研究会选取以上的几个指标作为判定细胞成骨能力及是否向BMCs分化的指标。该实验选取了以上这些成骨相关基因，通过荧光定量的方法检测，淫羊藿苷组1的BMP2，OPN，BSP和Runx2的表达均明显高于其它组，淫羊藿苷组2基因表达高于高糖组和正常组，说明，淫羊藿苷能增强高糖环境下BMCs的成骨能力，这与谢晓伟等人研究的干细胞的成骨分化结果一致［13］。

由以上可知，淫羊藿苷增强高糖环境下颌骨BMCs的成骨能力。但其具体通路机制还有待于进一步研究。

［1］史晓治，赵咏芳，郭海玲.骨碎补总黄酮与淫羊藿苷对人骨髓基质干细胞增殖及蛋白表达的影响 ［J］.中医学报，2015（5）∶693-695.

［2］訾慧，李可强，郑洪新.补肾壮骨滴丸中淫羊藿苷在骨质疏松模型与正常大鼠体内组织分布比较 ［J］.中华中医药学刊，2015，33（12）∶2856-2859.

［3］刘童斌，袁月，赵钰婷，等.载淫羊藿苷缓释电纺纤维对成骨细胞影响的实验研究 ［J］.实用口腔医学杂志，2015，31（6）∶770-775.

［4］石文贵，李雪雁，陈克明，等.基于cAMP-PKA信号通路的淫羊藿苷促进骨形成研究 ［J］.中国现代应用药学，2015，32（2）∶131-136.

［5］史晓治，赵咏芳，郭海玲.骨碎补总黄酮与淫羊藿苷对人骨髓基质干细胞增殖及蛋白表达的影响 ［J］.中医学报，2015，30（5）∶693-695.

［6］马小妮，石文贵，谢艳芳，等.淫羊藿苷对体外培养骨髓基质细胞成骨性分化的影响［J］.解放军医药杂志，2015，27（3）∶16-19.

［7］笪巍伟，赵永见，王拥军，等.淫羊藿苷对前成骨细胞株OCT1细胞BMP-2 mRNA、Runx-2 mRNA表达的影响［J］.上海中医药杂志，2015，49（5）∶90-94.

［8］俞吉，朱裕林，桑冉，等.高效液相色谱法测定骨疏灵颗粒中淫羊藿苷含量［J］.实用药物与临床，2015，18（6）∶691-693.

［9］傅淑平，杨丽，洪浩，等.淫羊藿苷促SD大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化作用的实验研究［J］.中国中西医结合杂志，2015，5（7）∶839-846.

［10］孙闯，杨大威，姜明久，等.不同浓度的淫羊藿苷治疗人工关节周围骨溶解的体外测试［J］.哈尔滨医科大学学报，2015，49（3）∶214-218.

［11］马小妮，石文贵，谢艳芳，等.淫羊藿苷对体外在无地塞米松培养基中诱导培养大鼠骨髓基质细胞成骨性分化的影响［J］.安徽医药，2015，19（1）∶43-47.

［12］王洪家.双波长HPLC法同时测定壮骨止痛颗粒中淫羊藿苷、延胡索乙素和蛇床子素含量［J］.天津药学，2015，27（4）∶17-19.

［13］谢小伟，裴福兴，康鹏德，等.锶盐联合淫羊藿苷对大鼠骨髓基质干细胞成骨及成脂分化影响的研究［J］.中国矫形外科杂志，2015，23（5）∶450-458.

Effect of the Content of the Bone Marrow Stromal Cells of Rat Bone Marrow Stromal Cells under High Glucose Condition

LI Chun-mei1，WANG Xin1，ZHOU Li-qun2，KANG Li-xun1，LI Hai-qing1，MA Sheng-li1
1.Department of Stomatology，Heilongjiang Hospital，Harbin，Heilongjiang Province，150001 China；2.Department of Obstetrics，Heilongjiang Hospital，Harbin，Heilongjiang Province，150001 China

R285

A

2096-1782（2016）06-0008-04

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.06.008

哈尔滨市科技局科技创新人才研究专项基金（2014RFQGJ018）。

李春梅（1981-），女，黑龙江哈尔滨人，硕士，主治医师，主要从事口腔内科的临床研究工作。

2016-05-04）