模拟水样中甲肝病毒超滤浓缩和PEG浓缩方法的比较

赵霖　周文亭　曹经瑗　毕胜利

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所



模拟水样中甲肝病毒超滤浓缩和PEG浓缩方法的比较

赵霖周文亭曹经瑗毕胜利

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

【摘要】目的比较模拟水样中甲肝病毒(HAV)超滤浓缩和PEG浓缩方法，为水中HAV检测提供参考。方法向模拟水样中接种已知量的HAV，分别选用Millipore和Sartorius公司的100KD和50KD孔径的微孔超滤管及终浓度为10%聚乙二醇(PEG)-1M氯化钠(NaCl)沉淀的方法对模拟水样进行浓缩，采用荧光定量RT-PCR方法检测浓缩后的病毒量，用SPSS21.0对数据进行统计学分析。结果采用同一孔径不同厂家的超滤管浓缩病毒无统计学差异 (P=0.25，P=0.532),对浓缩后的CT值及回收量进行分组比较，结果均表明不同处理方法有统计学差异(P=0.000<0.05，P=0.000<0.05)，其中50KD组浓缩病毒回收率为(94.57±16.26%)，100KD组浓缩病毒回收率为(52.37±14.75%)，10%PEG-1.0MNaCl沉淀病毒回收效率为(63.5±8.45%)。结论超滤和PEG沉淀两种方法均可用于水样中HAV浓缩，超滤管浓缩病毒操作简便，耗时更短，选择合适孔径可以提高HAV病毒回收率,本实验中50KD超滤管HAV回收率高于100KD；PEG更适用处理大体积样本。

【主题词】甲肝病毒；病毒浓缩；PEG浓缩；超滤； 荧光定量RT-PCR

近年来肠道病毒导致的疾病时有发生，如：胃肠炎、肝炎等，严重威胁人类健康。其中，甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)属微小RNA病毒科，肝病毒属，能够通过受污染的水和食物经粪口途径传播，临床上以疲乏、食欲减退、肝肿大、肝功能异常为主要表现，部分病例出现黄疸，主要表现为急性肝炎。HAV通常在受污染环境水体中的病毒浓度较低，难以直接检测，细胞培养可以用于分离培养HAV，但此方法存在操作繁琐、细胞培养周期长等缺点。常通过各种物理方法，对大量水体中的病毒进行浓缩和富集来提高样品中HAV病毒浓度[1]。国内外已经报道了多种病毒浓缩方法，如阴阳离子膜吸附洗脱、有机絮凝沉淀、阴阳离子交换等方法，其中病毒吸附在阴阳离子微孔滤膜上的浓缩方法，常用一定比例的牛肉膏甘氨酸混合液(PH9.5)作为洗脱液，洗脱滤膜上的病毒，但第一步浓缩后病毒浓度不能满足直接检测的目的，一般需要第二步浓缩，常用的方法有：絮凝沉淀、透析、超速离心、PEG沉淀、超滤等，但病毒的回收效率受操作者的熟练程度以及试剂、仪器和外界环境干扰因素的影响较大[2]。本研究选择了含1.5%牛肉膏(Beef)-0.05mol/L(M)甘氨酸(GBE)的纯净水作为模拟水样(模拟第一步浓缩洗脱下病毒的洗脱液)，选择了两种(超滤和PEG沉淀)具有代表性的第二步浓缩方法进行实验，利用荧光定量RT-PCR对病毒核酸进行检测，比较分析各种影响病毒回收率的因素。

1材料与方法

1.1实验材料，仪器和试剂冻干甲肝减毒活疫苗(Hepatitis A Attenuated Live Vaccine，HepA-L)由长春生物制品研究所提供；超滤管S50和S100：Vivaspin® Turbo 15超滤离心管，购自Sartorius公司；超滤管M50和M100：Amicon® Ultra 15超滤离心管，购自Millipore公司，截留分子量分别为50 KD和100 KD。PEG8 000购自Merck公司。

病毒RNA提取试剂盒购自Omega公司；Realtime-RT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；Realtime-RT-PCR引物及探针合成自生工生物工程(上海)股份有限公司；牛肉粉(Beef extract powder)购自Oxoid公司；甘氨酸(Glycine)购自AMRESCO公司

1.2实验方法

1.2.1HepA-L稀释液及常用溶液配制：取1支冻干HepA-L，根据说明书，加入适量DEPC水溶解， HepA-L病毒浓度为100TCID50/ μl，置4℃冰箱保存备用。

1.5% Beef-0.05 M GBE洗脱液：取1.5 g牛肉粉，0.375 g甘氨酸，加蒸馏水定容至100 ml，搅匀，调pH至7.0，高压灭菌;根据文献[33]选用终浓度为10%PEG-1.0M NaCl ,配制2×PEG-NaCl母液：取20 g PEG、11.7 g NaCl，加蒸馏水定容至100 ml，得到20% PEG-2.0M NaCl母液，调pH至7.0，高压灭菌。

1.2.2配制模拟水样浓缩液: 取6 ml 1.5%Beef-0.05M的GBE溶液至三角瓶，加入上述HepA-L溶解液，使终病毒量为1500 TCID50，于恒温摇床中120 rpm/min，震荡20 min。

1.2.3超滤浓缩和PEG浓缩HAV流程: 实验中用到的超滤管提前一天按照说明书预处理。为保证实验的准确性每个超滤离心管都是一次性使用。

A将混匀的模拟水样病毒液分别倒入超滤管S100或S50中,4℃离心1 000×g(非固定转角离心机)，前者离心12～15 min,后者离心15～30 min,收集到浓缩液200 μl，按照超滤管说明书清洗滤管底部，收集浓缩后的HAV于1.5 ml Ep管中，用于提取HAV RNA。

B将混匀的模拟水样病毒液倒入超滤管M100或M50中，4℃离心2000×g(非固定转角离心机)，前者离心15～20 min,后者离心30～50 min，收集到浓缩液200 μl，按照超滤管说明书清洗滤管底部，收集浓缩后的HAV于1.5 ml Ep管中，用于提取HAV RNA。

C将混匀的模拟水样病毒液，加入等体积的2×PEG-NaCl母液，于4℃恒温摇床中120 rpm/min，震荡20 min混匀，4℃冰箱静置沉淀过夜。第二日，4℃，10 000×g，离心30 min。弃去上清，用250 μl DEPC水清洗离心管底部，收集浓缩后的HAV于1.5 mL Ep管中，用于提取HAV RNA。

上述3个处理方法各自重复5次，每次实验有3个复孔。

1.2.4病毒核酸的提取: 根据硅基质材料吸附RNA的原理，利用OMEGA公司病毒RNA提取试剂盒(E.Z.N.A.® Viral RNA Kit)对浓缩后的上述样品进行提取纯化总RNA。将200 μl浓缩的病毒液加入配制好的GBE溶液至终体积280 μl，根据说明书,分成两管分别加入裂解液，硅基质材料吸附核酸时合并进行总核酸提取，提取出的总HAV RNA洗脱于50 μl DEPC处理的水中。

1.2.5荧光定量RT-PCR的引物、探针及反应条件: 根据文献[4, 5]，选取位于5’NCR的引物和探针，序列如下：上游引物：5’-GGTAGGCTACGGGTGAAAC -3’；下游引物：5’-CCTCCGGCGTTGAATGGTTT-3’；探针序列：5’-FAM-ACAGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGA-BHQ1 -3’：根据One Step PrimeScript TM RT-PCR Kit说明书，配制反应体系， RNA样本5 μl，总反应体系为20 μl。

表1　浓缩方法概况

反应条件：42℃，30 m；95℃，10 s；扩增40个循环：95℃，5 s；60℃34 s。以Ct值<36作为检测结果阳性的判断标准。

1.2.6回收率计算及统计学处理: 根据如下公式log10Q/Q0=(CT0-CT)/3.32，计算不同处理浓缩后的病毒回收率，其中Q、Q0分别代表浓缩后检出的HAV RNA的含量、浓缩前HepA-L稀释液RNA的含量，Ct、CT0分别代表浓缩后检测的Ct值、浓缩前HepA-L稀释液检测的Ct值[6]，得Q=10^(CT0-CT)/3.32)*Q0; 回收率=Q/Q0*100%,其中Q0为1500TCID50。

2结果

2.1超滤管浓缩及PEG沉淀处理表1中表明超滤管浓缩及PEG沉淀处理过程。其中10%PEG-1.0MNaCl需要4℃冰箱静置沉淀过夜，而超滤管浓缩可以即时处理。PEG沉淀过后终体积250 μl为加入的DEPC水,而超滤管浓缩的终体积是超滤管的截留体积200 μl。

2.2CT值的比较对同一孔径不同厂家的超滤管浓缩病毒的Ct值进行两两比较, 非参数Mann-Whitney U 秩和检验结果显示S100与M100差异无统计学意义(P=0.25),参数T检验结果表明S50与M50差异无统计学意义(P=0.532)如表2所示；因此将S100与M100超滤管分为100 KD组，S50与M50分为50 KD组;分组后对浓缩后病毒的Ct值进行方差分析，结果显示不同处理方法差异有统计学意义(P=0.000<0.05)，说明这几种处理方法对病毒浓缩效果不同。进一步两两比较显示50 KD组与100 KD组和10%PEG-1.0MNaCl差异均有统计学意义(P=0.000<0.05,P=0.024<0.05)：100 KD组与10%PEG-1.0MNaCl差异无统计学意义(P=0.304)如表3所示。

Ct值均值结果显示S50 与M50超滤管浓缩病毒的Ct值在三组数值中最小(27.26±0.26)说明它的回收效果相对最好； S100与M100超滤管浓缩病毒的Ct值在三组数值中最大(28.15±0.47)，说明它的回收效果相对最弱；10%PEG-1.0MNaClCt值(27.82±0.19)，在三组数值中居中(见表3)。

表2　同一孔径不同厂家的超滤管Ct值的比较

表3　浓缩前后CT的比较

注：*表示结果差异有统计学意义(P<0.05)

Note：*Statistically significant difference(P<0.05)

表4　浓缩后病毒量的比较及病毒回收率

注：*表示结果差异有统计学意义(P<0.05)

Note：*Statistically significant difference(P<0.05)

2.3病毒回收量的比较及病毒回收率对模拟水样浓缩后的病毒回收量进行方差分析结果显示不同处理方法对病毒的回收率差异有统计学意义(P=0.000<0.05)，两两比较显示50 KD组与100 KD组和10%PEG-1.0MNaCl差异均有统计学意义(P=0.000<0.05，P=0.004<0.05)，100 KD组与10%PEG-1.0MNaCl差异无统计学意义(P=0.597)如表4所示。

病毒回收率均值结果显示50 KD组的回收率较高(94.57±16.26%)，100 KD组的回收率较低(52.37±14.75%)，10%PEG-1.0MNaCl沉淀回收效率居中(63.5±8.45%)。从表4中可以看出，截留分子量为50 KD 的超滤管回收率普遍高于截留分子量为100 KD的超滤管。对于浓缩水中甲肝病毒，相比较100 KD超滤管，50 KD的超滤管回收效率更高，但离心时间也更长。

3讨论

检测水体中HAV主要困难：一是病毒含量较低，通常难以直接检测；二是HAV细胞培养困难。因此首先需要将水体中的HAV进行浓缩，然后利用灵敏度较高的分子检测技术对HAV的核酸进行检测。有些浓缩方法一步浓缩后需要选择合适的洗脱液用合适的方法将病毒从过滤膜上洗脱下来，但病毒浓度常不能达到检测要求，需二次浓缩。经过优化，我们选择了1.5%Beef-0.05M GBE(PH9.5)溶液作为模拟一步浓缩洗脱后的水样进行二步浓缩研究。

超滤浓缩是较为常见的病毒二步浓缩技术，该方法用于脊髓灰质炎病毒、诺如病毒的富集和浓缩，并取得了良好回收效果；超滤是一种以微孔滤膜为过滤介质，以压力为驱动力，利用膜孔选择性筛分性能，迫使小分子物质透过膜，大分子被膜截留从而进行分离、浓缩样品的方法[8]。超滤浓缩病毒，回收率受孔径大小影响明显，我们实验中表明HAV回收时50 KD超滤管HAV回收率比100 KD超滤管更高，推测可能是50 KD孔径小于100 KD孔径,样品大小等也可能影响病毒回收效率,详细原因有待进一步探索。有文献报道[9]，用惰性蛋白封闭超滤管过滤装置可以提高浓缩病毒的回收率，本研究模拟的病毒浓缩液是加入了牛肉膏甘氨酸等蛋白的混合液，本身含有蛋白，已具有封闭作用。

与超滤管浓缩相比较，PEG沉淀更经济实用，因需要沉淀过夜，操作时间比超滤管浓缩要长， PEG处理样本的体积比超滤管浓缩更灵活。我们经预实验优化后选用了终浓度为10%PEG-1.0MNaCl，初始模拟水样为牛肉膏-甘氨酸缓冲液(模拟经过一次浓缩的病毒浓缩液)。我们曾在预实验中向相同体积(6 ml)的超纯水或牛肉膏-甘氨酸缓冲液中加入相同量的HepA-L病毒液，经相同浓度PEG沉淀浓缩后，含牛肉膏-甘氨酸缓冲液的沉淀浓缩效果更好。推测可能是含有牛肉膏的缓冲液中有蛋白质等物质，增加了PEG分子与HAV颗粒的接触机会，PEG通过空间位置排斥，使水样中的 HAV颗粒集聚在一起，浓度超过其溶解度而发生沉淀[10]。对于含有杂质较少的待测水样加入牛肉膏甘氨酸等蛋白物质，回收效果可能会更好，本实验终浓度为10%PEG-1.0MNaCl沉淀浓缩后病毒回收率63.5±8.45%，分析影响回收率的因素[22]，不同的沉淀条件、操作手法，不同浓度的PEG及NaCL对病毒回收率都有一定影响。还有可能的原因是我们选用的是甲肝的减毒疫苗作为初始加入病毒，不同的初始加入病毒对回收率也有一定的影响。另外，相同浓度的PEG对不同的病毒的回收率也不相同。有文献报道改变模拟洗脱液的蛋白成分和浓度可以提高病毒回收率，值得进一步研究。

综上所述，超滤和PEG两种方法均可用于HAV浓缩，超滤管操作简便，耗时较短，选择合适孔径可以提高病毒回收率，但不适合处理体积过大的病毒液；PEG更经济实用，得率适中，试剂来源方便，样品量范围广，这为HAV研究提供了参考价值。

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通信作者：曹经瑗，Email: caojy@126.com

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(收稿日期：2016-01-04)

Comparison of hepatitis A virus concentration methods from simulated water samples using Ultrafiltration and PEG precipitation

ZhaoLin,ZhouWenting,CaoJingyuan,BiShengli

NationalInstituteForViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,ChinaCorrespondingauthor:Caojingyuan,Email:caojy@126.com

【Abstract】ObjectiveTo compare concentration methods of ultrafiltration and PEG precipitation for hepatitis A virus(HAV) in simulated water samples, and provide a reference for detection of HAV in water. MethodsQuantitative HAV was inoculated in the simulated water samples. Millipore, Sartorius, 100KD and 50KD aperture microporous ultrafiltration centrifuge tubes and the final concentration of 10% polyethylene glycol (PEG) -1M sodium chloride (NaCl) precipitation method were selected to concentrate HAV. The concentration of virus was detected by fluorescence quantitative RT-PCR method. The data were statistically analyzed with SPSS21.0. ResultsThe comparison of CT value and recovery rate shows that there were significant differences in different treatment methods (P<0.0001, P<0.0001). There were not statistically significant between ultrafiltration centrifuge tubes that they produced by different factory but with the same aperture (P=0.25, P=0.532), 50KD group had a higher recovery rate(94.57± 16.26%)than 100KD group (52.37± 14.75%) and the 10%PEG-1.0MNaCl (63.5 ± 8.45%)was in middle of them. ConclusionsBoth methods of ultrafiltration and PEG precipitation can be used for HAV concentration in water samples, the ultrafiltration centrifuge tube has the advantages of simple operation, less time-consuming and so on, select the appropriate aperture can improve the recovery rate of HAV virus. The HAV recovery rate of 50KD ultrafiltration centrifuge tube is higher than 100kD; PEG is more economical and practical, also it can process a large volume sample.

【Key words】Hepatitis A virus; viral concentration; PEG; ultrafiltration; fluorescence quantitative RT-PCR