单纯疱疹病毒性角膜炎兔角膜表面温度的改变与角膜损伤关系的研究

俞莹　缪晚虹　赵芳　李菲菲

201203 上海中医药大学附属曙光医院



单纯疱疹病毒性角膜炎兔角膜表面温度的改变与角膜损伤关系的研究

俞莹缪晚虹赵芳李菲菲

201203 上海中医药大学附属曙光医院

【摘要】目的研究单纯疱疹病毒性角膜炎兔角膜表面温度的变化及其与角膜损伤的关系。方法采用HSV-1 KOS病毒株感染兔角膜建立单纯疱疹病毒性角膜炎模型12只，对照组10只行单纯角膜上皮划开，不接种病毒。红外线测温仪检测角膜温度。造模后第1天、第3天、第7天、第14天观察角膜上皮病变面积、角膜基质混浊程度、新生血管生长情况并评分。结果测得单纯疱疹病毒性角膜炎兔角膜温度为31.14±1.12℃。造模后第1天、第3天、第7天、第14天角膜温度皆高于对照组(P<0.01,P<0.05)。第3天、第7天、第14天角膜基质明显混浊，且第3天、第7天混浊程度与角膜表面温度具有相关性(P<0.05)。第14天角膜新生血管明显增多，与角膜表面温度具有相关性(P<0.05)。结论单纯疱疹病毒性角膜炎角膜表面温度增高，且与角膜混浊程度、新生血管等角膜损伤表现有相关性。

【主题词】单纯疱疹病毒性角膜炎；角膜温度；角膜损伤；实验研究

Fund programs: Shanghai Natural Science Foundation For Young Scholars(12ZR1450600); Three-year Plan of Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning (ZY3-JSFC-1-1019)

单纯疱疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis, HSK)是常见的角膜感染性疾病，主要由于感染单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simplex viru-1，HSV-1)引起。病变的开始常由于病毒本身造成的组织损伤，但随着疾病的进展，免疫反应为组织破坏的重要因素，临床表现为角膜水肿及新生血管生成。角膜表面温度在很多研究中被发现与眼表疾病甚至眼底疾病存在一定的相关性，且检测手段方便可行，因而被越来越多应用于临床辅助诊断。作者在研究中发现病毒性角膜炎角膜表面温度亦发生改变，并与角膜损伤程度有一定相关性，现报道如下。

1材料与方法

1.1动物和分组健康新西兰大耳白兔25只[上海市松江区车墩养殖场，许可证号：SCXK(沪)2012-0008]，经裂隙灯检查，排除眼部疾患。所有实验兔随机分为病毒接种组15只，对照组10只。所有实验兔以右眼为实验眼。

表1　HSK造模前后角膜温度比较(℃)

1.2主要仪器佳信CA380 红外线测温仪(深圳市优仪高电子科技有限公司)：测温范围：-32℃～380℃；精确度±1.5℃；响应时间：500 ms。裂隙灯显微镜：苏州六六视觉科技股份有限公司，型号：YZ-5T。

1.3细胞与病毒HSV-1KOS病毒株及VERO细胞由上海中医药大学病毒免疫实验室提供。VERO细胞孵箱的工作条件：温度37℃，空气浓度95%，CO2浓度5%。

1.4实验兔的处理病毒接种组采用爱尔卡因滴眼液(美国爱尔康公司)行表面麻醉后，开睑器撑开眼睑，用刀片对兔角膜行以瞳孔缘为内径的放射状向外切开，共8处，深度以划开角膜上皮为标准。采用含病毒浓度为4×107pfu/ml的DMEM7 μl滴于放射状划开角膜上皮的角膜表面，使角膜暴露10 s后放开开睑器，闭合眼睑轻轻按摩5 s。对照组采用同样的方法行角膜上皮放射状切开，不接种病毒。

1.5病毒性角膜炎模型建立的判定标准参照夏丽坤[1]等HSK的检测方法,在 HSV-Ⅰ角膜接种后的第2～7天，每天用蘸有MEM的湿棉片擦拭右眼角膜表面的泪液膜，然后将其放入盛有1 000 μl MEM的试管中吹打6次，取200 μl角膜擦拭液移入上述VERO细胞培养板的一个孔中，继续培养1周，每天在相差倒置的显微镜下观察VERO细胞是否出现细胞病理学改变。在HSV-Ⅰ角膜接种后每天用裂隙灯显微镜检查角膜病变，凡是角膜呈现点状、树枝状、地图状且角膜擦拭液中有病毒复制的兔眼被判定为患HSK。所有确定为HSK的兔被纳入角膜炎组，角膜温度及评分记录被纳入统计。

1.6角膜温度测定方法控制环境温度为(25±2)℃。距离兔角膜10 cm处将瞄准光对准角膜中央，测定角膜温度，1s读数，重复三次，取平均值。

1.7观察指标造模前，模型建立后第1天、3天、7天、14天测定角膜中央温度。角膜观察评分：角膜上皮及基质损害的严重程度用0～4分评分[2-3]。角膜新生血管的评分标准：0分：无新生血管长人角膜；1分：新生血管向心性生长，但未达到瞳孔中央或未超过角膜半径；2分：新生血管达到瞳孔中央或超过角膜半径。

2结果

2.1HSK模型建立结果15只实验兔中12只在病毒接种后2～3 d出现角膜点状或树枝状改变，同时伴有CPE，VERO细胞表现为球形变、漂浮、集拢等，原本贴壁生长的细胞部分脱落、漂浮在培养液中，标志模型建立。 对照组10只兔角膜2～3 d后上皮皆愈合。

2.2兔角膜中央温度基础值31.14±1.12℃。

2.3HSK模型建立前后角膜温度比较(表1)：组内比较：HSK角膜炎组造模前后自身配对t检验，造模后1 d与造模前比较P=0.019(*代表P<0.05)，造模后3 d与造模前比较P=0.001(**代表P<0.01)，造模后7 d与造模前比较P=0.005(**代表P<0.01)，造模后14 d与造模前比较P=0.026(*代表P<0.05)。组间比较：HSK角膜炎组与对照组比较：造模后1 d，3 d，7 d，14 d两组间差异有统计学意义(△代表P<0.05)。

表2　HSK兔角膜评分与眼表温度

2.4HSK角膜炎组角膜评分及眼表温度造模后3 d、7 d、14 d与造模后1 d角膜基质病变评分比较，差异有统计学意义(P=0.0006，P=0.000，P=0.000)。造模后14 d角膜新生血管与造模后1 d比较差异有统计学意义(P=0.024)，其余时间点无差异。造模后各观察点角膜上皮病变面积评分无差异(P>0.05)，见表2。

2.5兔角膜温度与各评价指标的相关性分析角膜表面温度与角膜上皮病变面积评分在各时间点皆无统计学联系(P>0.05)。角膜表面温度与角膜基质混浊程度在第3天时相关系数r=0.629，显著性水平为P=0.028；第7天时相关系数r=0.616，显著性水平P=0.033；14 d时无显著相关(P>0.05)。角膜新生血管在14 d时与角膜表面温度的相关系数r=0.714，显著性水平为P=0.009。

3讨论

角膜位于眼球的前部，占眼表1/6的面积，具有屈光、透射、保护内眼的作用。红外线温度检测仪因为其无创和便捷的优点，被广泛应用于临床与生活。采用红外线测得人体角膜的温度为(32.06±1.24)℃[4]。对于兔角膜温度的测定研究较少，Freeman曾报道兔角膜生理温度为33～34℃[5]。本次研究中我们测得兔角膜平均温度为31.14±1.12℃，接近但略低于其报道值。可能与采用的仪器及检测方法有关。鉴于红外线测量结果易受仪器自身因素(发射率、测量距离及光斑的位置、大小) 和环境因素的影响，本研究选择非接触式红外线测温仪的发射率为0.95，接近角膜发射率(0.97～1.00)[6]。根据仪器特性，固定测定距离为距离角膜10 cm，以保证测得的范围聚焦于角膜，读数为角膜面积内的平均温度，提高检测准确性，尽量避免仪器自身误差。为减少环境误差，根据仪器要求，控制室温为(25±2)℃，尽量使实验结果可靠。

虽然角膜组织无血管，处于免疫赦免状态，但角膜的各种疾病，甚至内眼疾病、眼底疾病，都可引起角膜温度的改变。沈慧研等[7]报道蒸发过强型干眼者角膜温度高于非干眼者。但Versura等[8]报道干眼患者的角膜温度低于正常人。Fernando Galassi等[9]报道开角型青光眼患者眼表温度显著低于正常人。 Gonnermann等[10]报道翼状胬肉患者角膜表面温度低。对于眼表感染性疾病，有报道在细菌性角膜溃疡时，角膜的温度明显上升[11]。对于病毒性角膜炎的眼表温度尚未见报道。我们在实验中发现接种HSV-1建立病毒性角膜炎模型后，角膜温度明显升高(表1)，至造模后14 d，温度仍高于正常。

单纯疱疹病毒感染在临床较为常见，常表现为眼部及粘膜感染，亦可有病毒性脑炎，治疗以抗病毒为主，适时联合应用糖皮质激素可减轻炎症反应[12]。HSV-1通过直接感染粘膜组织致病，而角膜上皮是病毒感染与复制的重要场所。如病毒没有被迅速清除，则可使免疫因子聚集而引起角膜的免疫病理反应[13]。由中性粒细胞参与的炎性反应及T淋巴细胞介导的细胞免疫可导致角膜上皮坏死、基质水肿、新生血管及角膜溃疡形成。在感染性角膜炎中，角膜基质混浊水肿常因单核细胞、CD4、CD8+T细胞、趋化因子等的共同作用，因而基质混浊程度也反映了免疫炎症反应的程度。表2中可见，从造模后3 d起，角膜基质出现明显混浊，持续至造模后14 d。温度变化是局部组织炎症反应的有力表现，与炎症引起的血流加快，组织代谢增强有关[14]。我们发现在造模后3 d、7 d角膜温度的改变与病变造成的基质混浊有一定的相关性(P<0.05)。这也证明了角膜温度与炎症的程度相关。角膜新生血管是角膜疾病的常见并发症，降低了角膜的透明性，角膜新生血管的生长可改变角膜的“免疫赦免”功能。新生血管的发生与炎症、感染、外伤等多种因素有关[15,16]。造模后14 d，新生血管对比第1天明显增多(P<0.01)。而角膜温度与新生血管表现出一定的相关性(P<0.05)，考虑一方面与炎症反应相关，另一方面与新生血管引起的代谢增强有关。

测量角膜温度是一种实用便捷的了解眼部疾病的方法，我们的研究表明此方法同样适用于病毒性角膜炎的研究，且角膜温度与角膜基质混浊及新生血管具有相关性。进一步的临床研究仍有待进行，以证实其在临床的应用价值。

4参考文献

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通信作者：缪晚虹，Email: miaowanh@126.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.005

基金项目：上海市科委自然基金青年基金(12ZR1450600)；上海市卫计委三年行动计划(ZY3-JSFC-1-1019)

(收稿日期：2015-12-22)

The experimental research of cornea superficial temperature in herpes simplex keratitis and its relationship with cornea lesion

YuYing,MiaoWanhong,ZhaoFang,LiFeifeiShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiTraditionalChineseMedicineUniversity,Shanghai201203,ChinaCorrespondingauthor:MiaoWanhong,Email:miaowanh@126.com

【Abstract】Objective To study the change of cornea superficial temperature of herpes simplex keratitis(HSK) rabbits and the relationship between corneal temperature with cornea lesion. MethodsThe right eyes of the 12 rabbits that were diagnosed as HSK by being inoculated HSV-1KOS virus to the cornea were brought into the experiment group. The 12 right eyes of the control group were dealt with incision on the cornea epithelial layer without virus. The corneal temperature was measured with the infrared thermometer. The scale of epithelia damage, lesion of stroma and neovascular were observed before and at the 1stday, 3rdday, 7thday, 14thday after establishment of the HSK model. ResultsThe cornea superficial temperature of herpes simplex keratitis was 31.14±1.12℃. The temperatures at the 3rdday, 7thday, 14thday were all higher than those of the control group (P<0.01, P<0.05). The stroma opacity were rather serious at the 3rdday, 7thday, 14thday, and the temperatures of the 3rdday and 7thday were relevant to the degrees of stroma opacity(P<0.05). The neovascular was significantly increased at the 14thday, which was relevant to the cornea temperature (P<0.05).ConclusionThe cornea superficial temperature was increased in the case of herpes simplex keratitis, and the temperature was relevant to the degree of stroma opacity and neovascular.

【Key words】Herpes simplex keratitis; Cornea temperature; Cornea lesion; Experiment research