缓激肽刺激体外培养的视网膜色素上皮细胞炎症反应的作用机制

蔡雯婷，任成达，刘晴雨，危清泉，杜亚茹，王倩怡，刘俊伶，何梦梅，于　靖



·实验论著·

缓激肽刺激体外培养的视网膜色素上皮细胞炎症反应的作用机制

蔡雯婷，任成达，刘晴雨，危清泉，杜亚茹，王倩怡，刘俊伶，何梦梅，于靖

Department of Ophthalmology, the Tenth People’s Hospital of Tongji University, Shanghai 200072, China

Correspondence to:Jing Yu. Department of Ophthalmology, the Tenth People’s Hospital of Tongji University, Shanghai 200072, China. dryujing@aliyun.com

Received：2016-03-01Accepted：2016-07-05

•AIM: To investigate mechanism of bradykinin (BK) on inflammations of retinal pigment epithelium (RPE) cells.

•METHODS: ARPE-19 cells were culturedinvitro, stimulated by 100nM BK for 24h. Cell morphology changes were observed by microscope, and BK receptor localization was detected through cell immunofluorescence. Changes of Ca2+in BK and BR antagonist stimuli were detected by laser scanning confocal microscopy. The expressions of COX-1, COX-2, eNOS and iNOS protein in control group and BK group were detected by Western Blot.

•RESULTS: After the stimulation of BK, there was no significant changes of ARPE-19 cells in morphology. Kinin B1 receptors (B1R) and B2 receptors (B2R) could be detected in ARPE-19 cells. Compared with control group, Ca2+concentrations significantly increased in BK group; in B1R antagonist group and B2R antagonist group Ca2+concentrations increased less than BK group; B1R and B2R antagonist group showed no obvious changes in Ca2+concentrations. Compared with control group, COX-2 and iNOS protein concentrations were significantly increased in BK group (P<0.001).

•CONCLUSION: BK induces the increasing expression of COX-2 and iNOS in the cultured ARPE cells through binding with either B1R or B2R.

Citation:Cai WT, Ren CD, Liu QY,etal. Mechanism of bradykinin on inflammations of retinal pigment epithelium cells.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(8):1430-1434

摘要

目的：探讨缓激肽刺激体外培养的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞炎症反应的作用机制。

方法：体外培养ARPE-19细胞，100nmol/L缓激肽(bradykinin，BK)刺激24h后，光镜下观察细胞形态变化，细胞免疫荧光检测BK受体定位；共聚焦显微镜检测BK及其拮抗剂作用下Ca2+变化；Western blot检测对照组与100nmol/L BK处理24h后(BK组)COX-1、COX-2、eNOS、iNOS蛋白的表达量。

结果：BK刺激后，ARPE-19细胞形态无明显变化；ARPE-19细胞可检测到激肽B1、B2受体；与对照组相比，BK组Ca2+浓度显著升高；B1R拮抗组及B2R拮抗组的Ca2+浓度较BK组升高幅度降低，B1R及B2R拮抗组Ca2+浓度较对照组无明显变化；BK作用ARPE-19细胞后，COX-2及iNOS蛋白含量显著增加(P<0.001)。

结论：BK通过与B1R及B2R结合促进体外培养的ARPE细胞COX-2及iNOS表达增加。

关键词：缓激肽；增生性视网膜病变；环氧化酶；一氧化氮合酶

引用：蔡雯婷，任成达，刘晴雨，等.缓激肽刺激体外培养的视网膜色素上皮细胞炎症反应的作用机制.国际眼科杂志2016;16(8):1430-1434

0引言

诸多眼底病在原发或者继发病程中出现增殖性改变，统称为增生性视网膜疾病。常见的增生性视网膜疾病包括增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)、增生性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)等。目前有观点认为PVR是眼内一种异常的创伤愈合过程[1]，炎症反应对增生性视网膜疾病的发生具有重要作用[2]。

缓激肽(bradykinin，BK)是生理条件下激肽释放酶-激肽系统(kallikrein-kinin system，KKS)的主要激肽类物质，是KKS最终发挥效应的血管活性物质。本课题组一直致力于增生性玻璃体视网膜相关疾病的研究，我们前期通过蛋白质组学分析PVR和PDR的玻璃体，结果显示补体凝血级联(complement and coagulation cascades)是其中最重要的KEGG通路[3-5]，此提示该通路可能是增生性视网膜病变的共同通路。补体凝血级联由KKS、凝血系统和补体系统三部分组成。其中KKS为连接补体通路及凝血酶通路的中间过程，起关键性的调节作用。尽管BK在一些疾病中起着重要作用，但BK对RPE细胞的研究尚不明确。本研究拟通过BK对RPE细胞的炎症作用，探讨BK对增生性视网膜疾病的影响。

1材料和方法

1.1材料原代ARPE-19细胞(同济大学眼科研究所徐国彤教授馈赠)。缓激肽、HOE-140、Leu-8(Sigma公司)；B1R抗体、iNOS抗体、Western Blot相关二抗(Abcam公司)；B2R抗体(BD公司)；COX-1抗体、COX-2抗体、eNOS抗体(Cell Signaling Technology公司)。

1.2方法

1.2.1 BK对体外培养ARPE-19细胞形态学变化取冻存的原代ARPE-19细胞，37℃水浴，快速摇晃，直至冻存液完全融化，移入15mL离心管，离心(1000r/min，5min)，吸除冻存液，缓慢加入5mL培养液，用培养液(含有4%胎牛血清、2mmol/L左旋谷酰胺、0.1mmol/L非必需氨基酸的DMEM/F121∶1培养液)混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，置于5% CO2、37℃细胞培养箱中培养。每周1∶6传代，换液2次。传代4～6次，取培养的ARPE-19细胞，光镜下(×100)观察细胞形态，100nmol/L BK刺激24h后，观察细胞形态学变化。

1.2.2细胞免疫荧光BK受体定位取培养的ARPE-19细胞，4%多聚甲醛4℃固定，PBS漂洗，含10%胎牛血清及0.2% Triton的0.01mol/L PBS 37℃孵育。分别加入一抗(B1R抗体、B1R抗体，1∶200)，37℃孵育1h，4℃冰箱中过夜，孵育二抗(1∶200)，染核(DAPI，1∶200)，封片后共聚焦显微镜下观察。

1.2.3检测BK及其拮抗剂对细胞内Ca2+浓度的影响取培养的ARPE-19细胞，计数1×104个。将Fluo-3/AM配制为1mmol/L原液，-20℃避光保存。F-127用DMSO配制成20%溶液(W/V)。用无血清无酚红培养液将Fluo-3/AM稀释成终浓度10μmol/L，并加入0.1%Pluronic F-127备用。移去培养液，PBS冲洗2次，加入10μmol/L染料液1mL，置于5% CO2、37℃培养箱避光孵育30min。将染色后的ARPE-19细胞用PBS液冲洗3次，加入1mL DMEM液后用共聚焦显微镜观察，LaserSharp 2000软件扫描记录无处理组细胞内Ca2+浓度，待基线稳定后，其余各组分别给予如下刺激为：BK 100nmol/L刺激(BK组)、BK刺激前预敷100nmol/L B1R拮抗剂Leu-8(B1R拮抗组)、BK刺激前预敷100nmol/L B2R拮抗剂HOE-140(B2R拮抗组)、BK刺激前预敷100nmol/L Leu-8及HOE-140(B1R及B2R拮抗组)，记录刺激后图像变化。

1.2.4 Western blot检测COX-1、COX-2、eNOS及iNOS下游炎症相关蛋白的表达取培养的ARPE-19细胞，无BK处理(对照组)与100nmol/L BK处理(BK组)24h后，加入蛋白裂解液，30min后离心(12000r/min，15min)，酶标仪定量后电泳分离，再转入硝酸纤维膜，室温封闭1h。分别加入一抗(COX-1、COX-2、eNOS、iNOS及β-tublin，1∶1000)湿盒内4℃过夜，加入二抗，37℃下孵育40min，漂洗3次，每次10min，试剂盒显色，以β-tublin为内参照，检测COX-1、COX-2、eNOS及iNOS蛋白相对表达量。

图1100nmol/L BK刺激24h后ARPE-19细胞培养形态学变化(×100)A：无BK刺激组；B：100nmol/L BK刺激组。

2结果

2.1 BK对ARPE细胞形态的影响光镜下(×100)观察ARPE-19细胞形态，贴壁生长，细胞无色透明，细胞形态呈扁平多角形。BK 100nmol/L刺激24h后，细胞形态未见明显变化(图1)。

2.2 BK受体在ARPE细胞的分布通过细胞免疫荧光的检测显示，BK受体B1R及B2R在ARPE-19细胞上均有分布，且在细胞膜、细胞质及细胞核中均可检测到(图2)。

2.3 BK及其拮抗剂对细胞内Ca2+浓度的影响无BK刺激时，细胞内Ca2+维持在一个相对稳定的基线水平(图3A)。给予100nmol/L的BK刺激后，细胞内Ca2+水平显著提高，且在随后的一段时间内维持一个较高水平，然后再逐渐回落至基线水平(图3B)。在BK刺激前分别给予B1R拮抗剂Leu-8及B2R拮抗剂HOE-140孵育，均可见峰值下降，且添加HOE-140后抑制程度更加显著(图3C、D)。同时给予Leu-8及HOE-140孵育，100nmol/L BK刺激不引起细胞内Ca2+水平的升高(图3E)。

2.4 BK对下游炎症相关蛋白含量的影响

2.4.1 BK对COX-1及COX-2的影响ARPE-19细胞在无BK处理时，几乎不表达COX-1，100nmol/L BK刺激24h后检测，COX-1含量无明显改变(图4A)；正常条件培养的ARPE-19细胞也很少表达COX-2，给予100nmol/L BK刺激后24h，COX-2含量显著增加(图4B，P<0.001)。

2.4.2 BK对iNOS及eNOS的影响正常条件培养的ARPE-19细胞内可检测到eNOS蛋白的表达，100nmol/L BK刺激24h后，eNOS含量无明显改变(图5A)；ARPE-19细胞iNOS表达量很少，给予100nmol/L BK刺激后24h检测，iNOS含量显著增加(图5B，P<0.001)。

3讨论

近年来大量研究认为，慢性亚临床的低度炎症与PVR、PDR的发生、发展密切相关[6]。我们前期研究结果显示，补体及凝血级联是不同增生性视网膜疾病的共同病理过程。其中BK是KKS的最终效应分子，可能在其发生发展中起重要作用，然而其具体的作用途径及效应尚不清楚。本文通过体外培养ARPE，探讨BK及其受体的作用途径。

图2细胞免疫荧光检测BK受体在ARPE细胞的分布A：B1R在ARPE-19细胞上定位；B：DAPI细胞核染色；C：A与B融合；D：B2R在ARPE-19细胞上定位；E：DAPI细胞核染色；F：D与E融合。

图3不同条件下细胞内Ca2+浓度变化A：无BK刺激；B：100nmol/L BK刺激；C：BK刺激前预敷10μmol/L B1R拮抗剂Leu-8；D：BK刺激前预敷10μmol/L B2R拮抗剂HOE-140；E：BK刺激前预敷10μmol/L Leu-8及HOE-140。

以往有报道称BK触发了Ca2+诱导的Ca2+释放[7-8]。在某些类型的细胞中，BK触发了Ca2+浓度的骤然上升，达到峰值，随着Ca2+的回收，浓度下降直至稳定。刚开始Ca2+的骤然上升，可能是由于BK激活了受体或第二信使介导的Ca2+。在我们这次研究中，在BK刺激前给予BK受体拮抗剂孵育后，峰值下降，这与以往的研究结果保持一致。

COX及NOS是重要的炎症相关蛋白，其在增生性视网膜疾病中的作用已有研究。有报道称，PVR及PDR中COX的表达均显著增加[9]，COX含量升高导致局部炎症反应增加，促进了疾病进展。此外，COX抑制剂在PDR的全身治疗中有一定作用[10]。以往的研究表明，iNOS在糖尿病患者及动物模型的视网膜中显著增加，其能通过产生NO来发挥潜在的视网膜毒害作用[11]，且iNOS抑制剂能显著抑制PDR中视网膜微血管的形成[12]。本研究通过对BK刺激前后炎症相关蛋白COX-1，COX-2，iNOS及eNOS含量的分析显示，BK刺激后COX-2及iNOS含量显著增加，提示二者可能是BK下游的效应分子。Inoue等[13]发现BK刺激大鼠背根神经节细胞后，COX-1含量不变，COX-2含量增多，前列腺素E2含量也随之增加，说明BK通过促进COX-2表达从而促进前列腺素E2合成。然而，对肾小叶间动脉的研究显示，BK对前列腺素的调节作用是通过COX-1而非COX-2产生的[14]。Lim等[15]对RPE细胞的研究显示，BK可以显著增加COX-2含量，而不影响COX-1含量，这与本研究结果是一致的。各研究中BK对COX-1及COX-2影响的不一致性说明BK的作用存在组织或细胞类型的差异性。BK作用于RPE细胞时，eNOS含量无明显变化，iNOS含量显著增加，提示iNOS是BK作用的效应分子之一。本研究发现，BK通过调节炎性介质的表达，刺激体外培养的视网膜色素上皮细胞发生炎症反应。

图4BK对COX-1及COX-2的影响A：BK对COX-1蛋白水平的影响；B：BK对COX-2蛋白水平的影响；C：COX-1蛋白表达灰度扫描经内参校正后结果；D：COX-2蛋白表达灰度扫描经内参校正后结果(对照组为无处理组，实验组为100nmol/L BK处理24h组；bP<0.01vs对照组)。

图5BK对eNOS及iNOS的影响A：BK对eNOS蛋白水平的影响；B：BK对iNOS蛋白水平的影响；C：eNOS蛋白表达灰度扫描经内参校正后结果；D：iNOS蛋白表达灰度扫描经内参校正后结果(对照组为无处理组，实验组为100nmol/L BK处理24h组；bP<0.01vs对照组)。

本研究显示，BK可以促进COX-2及iNOS表达，二者均是重要的炎性介质。BK是体内重要的血管活性物质，而PDR主要为微血管病变，因此二者之间可能存在一定关联。BK一方面可以激活iNOS表达，促进NO合成，扩张血管，改善缺血缺氧状况；另一方面，BK可以使视网膜微血管通透性增大，外渗的生长因子等将促进PDR进展[16]。因此，BK对炎症反应的影响能够指导临床上PDR疾病的治疗，BK与PDR的关系尚需进一步的实验研究。

尽管我们在BK对体外培养RPE细胞的作用上有所发现，但本研究仍存在一些不足之处。首先，KKS成分复杂，尽管BK是KKS最主要的效应分子，但系统内其他物质可能对RPE细胞的炎症反应有影响，这需要进一步研究。其次，本研究是基于体外正常培养的RPE细胞，未能在动物疾病模型上验证,以上我们将在后续研究中继续完善。

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基金项目：国家自然基金面上项目(No.81470648)

作者单位：(200072)中国上海市，同济大学附属第十人民医院眼科

作者简介：蔡雯婷，同济大学在读硕士研究生，研究方向：视网膜病。

通讯作者：于靖，毕业于上海交通大学，博士，副教授，副主任医师，博士研究生导师，上海市医学分会视光学分会委员，主持国家自然科学基金2项，获得上海市科技启明星培养计划、上海市卫生系统优秀青年人才培养计划资助，研究方向：视网膜病.dryujing@aliyun.com

收稿日期：2016-03-01 修回日期： 2016-07-05

Foundation item:National Natural Science Foundation of China (No. 81470648)

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.8.07

•KEYWORDS:bradykinin; proliferative vitreoretinopathy; cyclooxygenase; nitric oxide synthase

Mechanism of bradykinin on inflammations of retinal pigment epithelium cells

Wen-Ting Cai, Cheng-Da Ren, Qing-Yu Liu, Qing-Quan Wei, Ya-Ru Du, Qian-Yi Wang, Jun-Ling Liu, Meng-Mei He, Jing Yu

Abstract