缓激肽多肽片段间非共价作用的质谱研究

陈 琛 储艳秋 戴新华 方 向 丁传凡,*

(1复旦大学化学系激光化学研究所,上海200433;2中国计量科学研究院化学计量与分析科学研究所,北京100013)

1 引言

蛋白质分子是一切生命的基础,1它的结构和功能一直是生命科学领域内人们关注的主要问题之一.2目前大多数的理论认为,影响溶液中蛋白质分子结构的因素有多种,包括疏水作用、氢键作用、二硫键的形成等.3-5虽然经过数十年来科学家们的不断努力,已经取得了较大成就和进展,但由于多肽和蛋白质分子的分子内作用力的复杂性,多肽和蛋白质分子的气相构象等问题仍然需要作进一步深入的探讨.6-8

近几年以来,随着质谱学技术在生命科学中的广泛应用,有关气相多肽和蛋白质分子结构的研究取得了很多进展.随着软电离技术的发展,特别是电喷雾电离(ESI)9,10和基质辅助激光解吸电离(MALDI)11,12等技术的出现,多肽和蛋白质样品在分析过程中,可以“完整”地由溶液进入气相而被检测,接近生理状态下获得分子相互作用的化学计量比、结合势和能量等信息.13这种“软”电离技术不但使得一些热不稳定、强极性、难挥发的化合物可以被检测,而且使得质谱的应用范围从小分子扩展到蛋白质等生物大分子.因此,电喷雾质谱已经成为研究蛋白质以及多肽之间非共价相互作用的有效手段之一.14

质谱学探讨气相多肽分子的结构15具有独特的优点:第一,可以将感兴趣的某一种多肽分子单独“挑”出来开展研究,因此可以获得与这种多肽分子一一对应的化学或物理性质信息,而不是众多分子的平均信息;第二,由于可以获得去溶剂化情况下多肽分子的结构,因此可以排除溶剂化作用的影响,所得到的多肽主要考虑分子间氢键和疏水力的作用;第三,串级质谱分析技术还可以定量或半定量地获得多肽分子间或分子内相互作用键合强度的信息.例如,Koomen等16采用电喷雾质谱法等技术研究了强啡肽1-7和胃泌激素I这两种多肽间的非共价相互作用.结果发现,在pH 5-7的时候,强啡肽1-7和胃泌激素I可以形成非共价复合物,而且单个多肽不会形成二聚体.

缓激肽分子是由九个氨基酸缩合而成的多肽.缓激肽对于人体而言具有多种功能.17-21例如,缓激肽可以作为一种血浆激肽调节肌肉的收缩和舒张,调节毛细血管的渗透性,作为合成一氧化氮的选择性前体,可以参与血管紧张素转化酶抑制剂对心血管起保护作用,对小细胞肺癌起抑制作用等.因此,三维结构的气相缓激肽的空间构象引起了人们极大的兴趣.许多方法被应用于研究缓激肽的结构.例如,Lopez等22用固体核磁共振(NMR)的方法研究了与人体G-蛋白偶联受体B2结合的缓激肽的结构.Wyttenbach等23用离子色谱的方法研究了缓激肽分子的气相构象,得到了它们精确的碰撞截面.实验发现,由基质辅助激光解吸电离得到的三种阳离子形式的缓激肽离子(BK+H)+、(BK+Na)+、(BK-H+2Na)+具有几乎相同的碰撞截面(2.45±0.03)nm2.并且这些碰撞截面在300到600 K的温度下是相互独立的.

值得一提的有Rodriquez等24通过量子化学理论计算,预计气相缓激肽(序列为RPPGFSPFR)在空间可以形成稳定的构象.对于+1价缓激肽[BK+H]+而言,C端精氨酸残基的羧基和N端精氨酸侧链的胍基上的氮原子形成的氢键是缓激肽构象稳定的主要因素,也就是说,与溶液中相同,+1价缓激肽[BK+H]+在气相仍然可以形成两性离子(zwitterion).可以预见,缓激肽两端的精氨酸残基(R)对于其在气相中的稳定性起着至关重要的作用.

本文选用缓激肽分子(图1)为研究对象,研究分子内氢键对多肽空间结构的影响.Russell等25在对气相缓激肽离子构象的研究中发现,缓激肽分子中在丝氨酸与脯氨酸之间(图1中位置1),以及苯丙氨酸与丝氨酸之间(图1中位置2)易发生断裂.由此,我们想探讨分子的折叠是否由于其两边的多肽之间的非共价作用——氢键相互作用造成的,因此分别在断裂位置1合成对应的两种多肽RPPGFS和PFR,在断裂位置2合成多肽RPPGF和SPFR.此外,由于Rodriquez等24预计缓激肽两端的精氨酸残基(R)可以形成氢键,因此,我们又设计合成了去掉N端或者C端精氨酸的多肽PPGFS、PPGF、PF和SPF.采用电喷雾质谱研究了缓激肽两种断裂方式产生的多肽,以及缓激肽两端去掉精氨酸残基(R)后两种断裂方式产生多肽之间的非共价相互作用.通过对非共价复合物离子[A+B+H]+(A,B表示不同的多肽)的碰撞诱导解离,定性地比较了不同多肽间氢键的结合强度,并使用质谱滴定法定量地比较了缓激肽两端是否含有精氨酸对其构象稳定性的影响.

图1 缓激肽分子结构图Fig.1 Structure of bradykinin

2 实验部分

2.1 化学试剂

实验中所用的多肽样品RS-6(RPPGFS)、PR-3(PFR)、RF-5(RPPGF)、SR-4(SPFR)、PS-5(PPGFS)、PF-4(PPGF)、PF-2(PF)和SF-3(SPF)购于吉尔生化上海有限公司,中国,其序列及各项参数如表1所示.甲醇(纯度99.9%)购于Merck化学试剂公司,德国(Darmstadt,Germany),乙酸(纯度99.5%)购于国药集团化学试剂公司,中国.

2.2 多肽溶液的制备

将8种多肽样品溶于去离子水中,用含有0.1%醋酸的甲醇溶液(甲醇与水体积比为9:1)稀释成8×10-5mol·L-1的溶液.任选两种多肽样品配制得到摩尔比为1:1的多肽混合液,其中单个多肽的浓度为2×10-5mol·L-1.将得到的28组多肽混合液在25 °C的恒温箱内反应24 h.另配制单个多肽浓度为2×10-5mol·L-1的8种多肽混合液,在25°C的恒温箱内反应24 h待用.

表1 多肽样品序列及其它参数Table 1 Sequence and other parameters of peptide samples

2.3 电喷雾电离质谱的测定

Finnigan LTQ线性离子阱质谱仪(Thermo Finnigan,美国,m/z2000),电喷雾电离离子源(ESI),正离子扫描模式.采用流动进样分析(FIA),进样速率为5 μL·min-1.所用的助喷雾气和帘气均为高纯氮气(99.999%).电喷雾电离工作电压为3.5 kV,毛细管温度设为350°C.

2.4 碰撞诱导解离实验

为了探讨多肽与多肽相互作用形成的非共价复合物的结合强度,我们在不同的碰撞能量下对其进行了碰撞诱导解离(CID)的实验.碰撞诱导解离实验的测定与2.3节中所用仪器相同,氦气作为碰撞气体,离子活化参数Q值设为0.25,活化时间为30 ms,隔离宽度设为1m/z.

2.5 结合常数的测定

配制不同摩尔比(1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10)的多肽RS-6和多肽PR-3的混合液、多肽RF-5和多肽SR-4的混合液以及多肽PF-4和多肽SF-3的混合液,经过ESI-MS分析,由公式(1),26计算得到两个多肽之间的结合常数Kst.定义Kst=[A+B+H]+/([A][B]),定义Ir=Ic/(Ic+Ia),Ir代表质谱峰的相对强度,其中Ic和Ia分别表示非共价复合物[A+B+H]+和多肽A质谱峰的相对强度.Kc是常数,[A]、[B]表示两个多肽的初始浓度.

3 结果与讨论

3.1 电喷雾质谱结果

将合成得到的8种多肽混合溶液进样,ESI-MS结果显示,除去单个多肽的质谱峰外,存在两个多肽间的非共价结合峰,包括[PS-5+PF-4+H]+、[RF-5+PF-4+H]+、[2RF-5+H]+、[RS-6+RF-5+H]+以及具有相同m/z=1076.17的质谱峰[RS-6+PF-4+H]+和[RF-5+PS-5+H]+,如图2所示.可以发现这些非共价结合峰对应的两个多肽具有相似的序列,其中一个多肽完全包含另一个多肽的序列,例如多肽PS-5(PPGFS)和PF-4(PPGF),故这类非共价结合峰类似单个多肽二聚体的非共价结合峰,例如[2RF-5+H]+.而m/z=1078.42的结合峰对应[RS-6+PR-3+H]+和[RF-5+SR-4+H]+,是多肽RS-6和多肽PR-3以及多肽RF-5和多肽SR-4在自由竞争的环境下,形成较强的非共价结合质谱峰,而这两条多肽正好对应缓激肽分子在位置1和2断裂形成的碎片多肽.由此可以证明缓激肽二级结构中的分子折叠是由于碎片多肽之间较强的氢键作用引起的.

3.1.1 不同断裂位置下碎片多肽之间的相互作用

在断裂位置1下合成得到两种多肽RS-6(RPPGFS)和PR-3(PFR),将其以1:1混合反应,得到的质谱图如图3(a)所示.m/z=1078.33所对应的分子离子为[RS-6+PR-3+H]+离子,它表明多肽RS-6和多肽PR-3之间存在非共价相互作用并形成了新的复合物.在断裂方式2下得到多肽RF-5(RPPGF)和SR-4(SPFR),同样以1:1混合反应,得到的质谱图如图3(b)所示.其中m/z=1078.42所对应的分子离子为[RF-5+SR-4+H]+离子,表明多肽RF-5和多肽SR-4之间也存在非共价的相互作用,并且形成了非共价复合物.可见,在这两处断裂位置下对应合成的两条多肽分子都能够再次结合,并形成非共价复合物,它说明缓激肽分子中这两条片段之间存在氢键作用.

图2 8个混合肽的电喷雾电离质谱图Fig.2 ESI mass spectra of 8 mixed peptides

图3 多肽组合(a)RS-6+PR-3,(b)RF-5+SR-4的电喷雾电离质谱图Fig.3 ESI mass spectra of peptide mixtures(a)RS-6+PR-3,(b)RF-5+SR-4

3.1.2 去掉N端或C端精氨酸后合成的多肽间的相互作用

将缓激肽分子N端的精氨酸(R)去掉后,在断裂位置1下合成得到PS-5(PPGFS)和PR-3(PFR)两种多肽,在相同的条件下以1:1混合反应,得到图4(a)所示的质谱图.其中m/z=922.17所对应的分子离子峰为[PS-5+PR-3+H]+离子.在断裂位置2下合成得到对应序列的多肽PF-4(PPGF)和SR-4(SPFR),同样条件下反应,得到图4(b)的电喷雾质谱结果,其中m/z=922.17是形成的非共价结合峰[PF-4+SR-4+H]+.

当将缓激肽分子C端的精氨酸(R)去掉后,断裂位置1下合成得到RS-6(RPPGFS)和PF-2(PF)两种多肽,将其以1:1混合反应,发现没有结合峰的质谱信号出现.将同时去掉缓激肽分子中N端和C端精氨酸后合成得到的多肽PS-5(PPGFS)和PF-2(PF)以1:1混合反应后,也未得到两者的结合信号.然而在断裂方式2下,去掉C端精氨酸后合成得到多肽RF-5(RPPGF)和SF-3(SPF);同时去掉N端和C端的精氨酸合成得到多肽PF-4(PPGF)和SF-3(SPF)都能够形成1:1的非共价复合物,所得到的质谱图如图4(c,d)所示.实验结果表明,缓激肽分子中N端的精氨酸对于两个多肽间相互作用的影响较小,而C端的精氨酸对其相互作用则影响较大.

图4 多肽组合(a)PS-5+PR-3,(b)PF-4+SR-4,(c)RF-5+SF-3,(d)PF-4+SF-3的电喷雾电离质谱图Fig.4 ESI mass spectra of peptide mixtures(a)PS-5+PR-3,(b)PF-4+SR-4,(c)RF-5+SF-3,(d)PF-4+SF-3

通过以上实验可以发现,在断裂位置2下,无论去掉N端或者C端的精氨酸,或者同时去掉N端和C端的精氨酸得到的两个多肽之间都是可以形成非共价结合的,如图4中(b,c,d)所示.说明在这种断裂方式下,由于一条多肽的N端为丝氨酸,它不仅存在一个氨基并且丝氨酸的侧链上含有羟基基团,从而容易与其他多肽之间形成氢键.

Wyttenbach等23的研究表明缓激肽在空间呈现紧密的球形结构(global).在缓激肽的优势构象中,在多肽序列Ser6-Pro7-Phe8-Arg9位置处有一个β-转角.而Russell等25在对气相缓激肽离子构象的研究中发现,缓激肽分子中苯丙氨酸与丝氨酸之间(图1中位置2)易发生断裂.因此,丝氨酸位置的β-转角可能是位置2易发生断裂的原因.而位置1中连接的是丝氨酸与脯氨酸,众所周知,脯氨酸的连接位点为容易发生断裂的位置.有趣的是,我们的研究发现,即使没有端位的精氨酸,带有丝氨酸的SPF仍然可以与PPGF结合,表明丝氨酸在缓激肽优势构象的β-转角中发挥重要的作用,即对于缓激肽二级结构的稳定起到了重要的作用.

3.1.3 任意两种多肽间的非共价结合情况

将8种多肽中任意两种以1:1摩尔比混合反应得到28组混合肽,其结合情况结果如表2所示.通过电喷雾质谱检测发现,多肽PF-2(PF)与其他大多数多肽无相互作用,这是由于多肽PF-2是由两个疏水的氨基酸脯氨酸(P)和苯丙氨酸(F)组成.其中脯氨酸是一种亚氨基酸,它的α氨基和侧链形成五元环的结构,而苯丙氨酸的侧链上含有一个苯环,这些结构都使得它们不容易与其他的多肽通过氢键等作用力发生相互作用.

表2 任意两个多肽混合后的非共价结合情况Table 2 Combination results of the mixture of two peptides

3.2 碰撞诱导解离实验

对上述28组混合肽中有相互作用组合的结合峰在不同的碰撞能量下进行碰撞诱导解离的实验.选取结合峰作为母离子,碰撞能量从10 eV开始增加,以氦气作为碰撞气体进行反应,如图5所示.表3显示的是开始出现对应的多肽碎片离子时的能量,以及母离子峰强度降低到最强碎片峰强度10%时的碰撞能量.由CID的实验结果可知,多肽组合RS-6+PR-3,RF-5+SR-4(分别对应与缓激肽分子在位置1、2断裂得到的碎片序列相同的多肽)其结合峰降低到最强峰强度的10%时所需要的能量较大,为50 eV,说明这两种多肽之间的非共价相互作用较强.而去掉N端精氨酸的多肽组合PS-5+PR-3和PF-4+SR-4中的两个多肽间的相互作用也较强,同样为50 eV,进一步说明了N端精氨酸对两条肽段之间的相互作用影响较小.而同时去掉N端和C端精氨酸的多肽组合PF-4+SF-3,他们之间的相互作用力相对较小,在25 eV的碰撞能量下,其结合峰的强度就降低到最强峰强度的10%以下.可见C端的精氨酸对于两条多肽链之间的相互作用有重要的影响.这也为解释缓激肽分子空间结构的形成提供了重要、可靠的基础信息.

3.3 结合常数的测定

Rodriquez等24通过量子化学理论计算,指出在+1价气相缓激肽中,C端精氨酸残基的羧基和N端精氨酸侧链的胍基上的氮原子可以形成氢键,+1价缓激肽[BK+H]+在气相仍然为两性离.Schnier等27通过黑体辐射实验也提供证据证明缓激肽在气相中含有一个盐桥的结构.为了定量比较N端或C端是否带有精氨酸对气相缓激肽分子的影响,我们测定了多肽RS-6和PR-3、多肽RF-5和SR-4以及多肽PF-4和SF-3两两之间的结合常数.

实验中,固定多肽RS-6的浓度为1×10-5mol·L-1,配制摩尔比为1:1、1:2至1:10的多肽RS-6与PR-3的混合液,其余两组溶液配制方法相同.经过ESI-MS分析,通过公式(1)可知,1/Ir和1/[B]之间存在线性关系,通过作图,结合常数Kst可由截距与斜率的比求得.实验中测得的三组多肽间的结合常数如表4所示.

图5 [RF-5+SR-4+H]+在不同碰撞能量下的CID结果Fig.5 CID results of[RF-5+SR-4+H]+at different collision energies

表3 多肽复合物的CID结果Table 3 CID results of peptide complexes

表4 三组多肽的结合常数及线性拟合方程Table 4 Linear equation and binding constants for three groups of peptides

根据文献,7反应的产率a1可以由公式(2)计算,其中Icomplex和Ipeptide1分别为复合物和其中一个多肽片段的质谱强度,计算结果也列于表4.

产率计算结果表明,端位不带精氨酸的多肽片段之间的反应产率(5%)要低于端位带有精氨酸的多肽RS-6与PR-3(10%)或与RF-5与SR-4(10%)的产率,产率的结果也表明端位带有精氨酸的多肽间更容易发生反应.

结合常数的数据表明,多肽RS-6与多肽PR-3(3.53×103),以及多肽RF-5与多肽SR-4(3.16×103)之间的非共价结合较强,而同时去掉N端和C端精氨酸的合成得到的多肽PF-4与多肽SF-3的结合(1.25×103)相对较弱.这也与上面碰撞诱导解离的实验结果一致.进一步说明N端和C端精氨酸的氢键结合对于缓激肽分子折叠起着重要的作用.

4 结论

用电喷雾质谱法结合碰撞诱导解离技术研究了基于缓激肽分子的碎片多肽片段之间的非共价相互作用.实验结果表明,在断裂方式1下,缓激肽多肽片段RS-6和PR-3之间可以形成1:1的非共价复合物.去掉缓激肽分子N端精氨酸后的多肽PS-5和PR-3也可以形成1:1的非共价复合物.当去掉缓激肽分子C端精氨酸后,RS-6和PF-2的反应液中没有结合的复合物的质谱峰出现.同时去掉N端和C端精氨酸后的多肽组合PS-5和FP-2其质谱图中,也没有结合的复合物质谱峰.断裂方式2下,合成得到多肽RF-5和SR-4,去掉缓激肽分子N端或者C端精氨酸后合成得到的多肽组合PF-4+SR-4、RF-5+SF-3、PF-4+SF-3,都能得到1:1的结合产物.通过碰撞诱导解离技术,确定了多肽与多肽之间形成的1:1非共价复合物.在不同的碰撞能量下,定性地分析了不同序列多肽之间相互作用强度的大小,结果发现RS-6+PR-3及RF-5+SR-4之间的非共价氢键相互作用比其他多肽间的非共价作用要强,自由竞争状态下形成的质谱峰也证实了这一点.同时去掉N端和C端精氨酸合成得到的多肽组合PF-4+SF-3的非共价结合较弱.质谱滴定法定量测得的RS-6和PR-3的结合常数为3.53×103,与RF-5+SR-4的结合常数(3.16×103)相接近,它们均大于去除精氨酸的PF-4+SF-3的结合常数(1.25×103).

综合质谱谱图分析、碰撞诱导解离以及质谱滴定的定量测定结果,可以判定丝氨酸位于气相缓激肽分子转角位置,而缓激肽分子两端的精氨酸之间的氢键作用对气相缓激肽分子构象的稳定起着重要作用.

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