CRLR基因单核苷酸多态性与原发性前房角关闭人群的关联研究

秦　柏，石海红，朱蓉嵘，张俊芳，杨　梅，管怀进



CRLR基因单核苷酸多态性与原发性前房角关闭人群的关联研究

秦柏，石海红，朱蓉嵘，张俊芳，杨梅，管怀进

Department of Ophthalmology, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu Province, China

Correspondence to:Hai-Hong Shi. Department of Opthalmology, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu Province, China. shihaihong2@163.com

Received：2016-04-25Accepted：2016-07-04

•AIM: To study the association of the single nucleotide polymorphism (SNP) rs1157699 in the calcitonin receptor-like receptor (CRLR) gene with primary angle closure (PAC) in a Han Chinese population.

•METHODS: All samples, involved 232 PAC cases and 306 controls, were obtained from an epidemiologic survey conducted in Funing, Jiangsu Province, China. Genotyping were carried out by TaqMan-MGB probe using the real time quantitative polymerase chain reaction system to study the relationship between SNP of rs1157699 in CRLR gene and PAC.

•RESULTS: The prevalence of CRLRrs1157699 genotype was 67.4%, 30.0%, 2.6% for CC, CT, TT in cases, and 71.3%, 27.0%, 1.7% in controls respectively. There was no difference between the two groups in the distribution of genotype and allele frequencies of rs1157699 (P>0.05).

•CONCLUSION: Our results do not support a significant role for rs1157699 in CRLR with PAC.

Citation:Qin B, Shi HH, Zhu RR,etal. Association of the single nucleotide polymorphisms in the calcitonin receptor-like receptor gene with primary angle closure in a Han Chinese population.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(8):1570-1572

摘要

目的：探讨降钙素受体样受体(calcitonin receptor-like receptor，CRLR)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorpnism，SNP)与汉族原发性前房角关闭人群的关联性。

方法：以流行病学人群为研究对象，采用病例对照设计。收集江苏省阜宁县流行病学调查中筛查出的原发性前房角关闭(primary angle closure，PAC)患者232例，正常对照306例。血样经DNA提取后采用TaqMan-MGB荧光探针法检测CRLR基因的rs1157699(C/T)位点SNP基因型，比较两组等位基因及基因型频率的分布。

结果：病例组的基因型分布(CC 67.4%，CT 30.0%，TT 2.6%)，对照组的基因型分布(CC 71.3%，CT 27.0%，TT 1.7%)，两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

结论：中国汉族人群的CRLR rs1157699位点SNP与原发性前房角关闭无相关性。

关键词：原发性前房角关闭；降钙素受体样受体基因；单核苷酸多态性；中国汉族人群

引用：秦柏，石海红，朱蓉嵘，等.CRLR基因单核苷酸多态性与原发性前房角关闭人群的关联研究.国际眼科杂志2016;16(8):1570-1572

0引言

青光眼是全球第二大致盲眼病，不可逆盲是最主要的原因[1]。原发性闭角型青光眼(primary angle-closure glaucoma，PACG)是我国青光眼的主要类型，至2020年我国PACG的患者数将达到1 009万，约占世界PACG总数的48%[1-2]。根据其自然病程可将PACG分为可疑原发性房角关闭(primary angle closure suspect，PACS)、原发性前房角关闭(primary angle closure，PAC)及PACG三个阶段[3]。

房角关闭最大的危险因素是浅前房和窄房角，但是只有10%窄房角的人会发生房角关闭[4]。如能找出引起窄房角发生房角关闭的关键因素，就有可能阻止房角关闭和青光眼的发生。有研究[5]发现在瞳孔括约肌过度表达降钙素受体样受体(calcitonin receptor-like receptor，CRLR)的转基因鼠易发生瞳孔散大和急性眼压升高。刘杏等做了CRLR基因的rs1157699单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与PACG的关联研究[6]，发现该基因多态性与原发性急性闭角型青光眼(acute primary angle-closure glaucoma，APACG)可能有关，而与原发性慢性闭角型青光眼(chronic primary angle-closure glaucoma，CPACG)无关。本研究以“江苏眼病研究”中筛查出的PAC人群为对象，进一步探讨该位点SNP与汉族PAC人群的关联性。

1对象和方法

1.1对象本研究是江苏眼病研究的一部分。研究方案经南通大学附属医院伦理委员会批准，所有参加者签署知情同意书。2011-05我们在盐城市阜宁县完成了PAC筛查，按偏倚控制要求统一管理现场调查，受检率达90%，其中血样标本收集率达95%，在接受调查的6 032人中筛选出年龄为50岁及以上的PAC 232例，对照组306例。病例组和对照组的一般情况见表1。两组间在性别、年龄、全身病等方面无统计学差异，具有可比性。

1.2方法

1.2.1分组标准病例组(PAC组)：参照国际地域性和流行病学眼科学组的PACG的分级方法进行分组[7]。(1)任一眼房角镜下或明、暗状态下UBM检查发现周边虹膜与后部小梁接触或粘连>180度；(2)至少有下列情况之一：眼压>21mmHg；小梁网上有过多的色素沉积；虹膜萎缩；青光眼斑；有急性发作过的症状；暗状态下UBM检查眼压较明状态下升高≥8mmHg。(3)无青光眼视盘损害(视盘杯盘比≤0.5)及视野缺损；(4)排除外伤、手术、葡萄膜炎等引起的继发性青光眼；既往无手术史及虹膜激光治疗史；排除视网膜脱离、黄斑变性及严重白内障影响眼底观察者；(5)四代内均为汉族。对照组：前房周边深度大于2/3CT(coneal thickness)；眼压小于21mmHg；无PACG家族史；视盘及视野正常；无明显眼部病变,除了轻微白内障不影响眼底观察者；屈光不正小于3个屈光度；四代内均为汉族。按性别、年龄与病例组频数匹配。

1.2.2研究方法

1.2.2.1病史和相关混杂因素收集除性别、年龄、职业、文化程度、居住地等一般资料外，收集研究对象与PACG相关的其他因素，如慢性支气管炎、糖尿病、高血压等全身病患情况；皮质类固醇等药物使用情况；青光眼手术史及家族史等。测量血压，检测血糖、肝肾功能、血脂、血粘度等。

1.2.2.2眼部基本检查参照我国九省眼病调查方案进行[8]，包括视力检查(远、近视力及日常生活视力)、裂隙灯检查、眼底检查、眼前节照相、眼底照相、Goldmann眼压检查、主觉验光和客观验光等。

1.2.2.3 PAC筛查对浅前房眼进行前房角镜、A超、UBM检查，Humphrey视野检查。(1)周边前房深度的检查：应用裂隙灯按Van Herick方法测量周边前房深度[9]。将周边前房深度≤1/3CT眼定为浅前房眼。(2)前房角镜检查：对浅前房眼行前房角镜检查，按Scheie分类法进行分级[10]。静态下不能满意看到房角隐窝时则在动态下检查。观察前房角宽度、入射角和虹膜根部形态。虹膜根部与后部小梁接触>180°为接触性关闭，虹膜根部与后部小梁粘连>180°为房角粘连性关闭，均纳入PAC组，否则为房角开放。(3)明、暗条件下的UBM检查：参照赵家良等的方法[11]，双眼分别进行UBM(SW-3200A型便携式UBM)检查。分别对受检眼上方、颞上方、颞侧、颞下方、下方、鼻下方、鼻侧及鼻上方8个位置进行检查，先在暗室下检查，结束后5min在距离受检眼30cm处的30W白炽灯照射下重复以上检查。记录前房角接触性关闭或粘连性关闭的范围。(4)视野检查：采用全自动视野计(Humphrey-720)进行中心及周边视野检查。(5)A超检查：眼科A/B超仪(B-SCAN)测量前房深度、晶状体厚度和眼轴长度。

表1研究对象的一般情况

一般情况对照组PAC组χ2/tP女性(例,%)268(87.58)209(90.09)0.82>0.05男性(例,%)38(12.42)23(9.91)平均年龄(x±s,岁)65.08±7.5364.84±8.590.34>0.05年龄范围(岁)50～8550～83高血压(例,%)66(19.64)46(19.83)0.16>0.05糖尿病(例,%)24(7.36)20(8.6)0.09>0.05脑血管疾病(例,%)10(3.27)4(1.72)1.18>0.05

1.2.3提取DNA收集血液样本：在知情同意的前提下，采集每个研究对象的外周静脉血，-4℃短暂保存。采用QIAGEN公司产品试剂抽提。(1)在200μL静脉血中加入20μL蛋白酶、200μL Buffer AL 吹打混匀；(2)56℃水浴孵化10min，短暂全速离心，加入200μL无水乙醇，充分混匀；(3)将混合液移至Spin Column，全速离心1min，将离心柱移至2mL收集管；(4)加入500μL Buffer AW1，8 000r/min离心1min，将柱移至新收集管；(5)加入500μL Buffer AW2，全速离心3min；(6)将柱放入1.5mL离心管中，加入200μL Buffer AE，室温下孵育5min，8 000r/min离心1min后-80℃保存。

1.2.4检测SNP采用TaqMan-MGB法。使用双探针分别探测PCR产物中所含的野生位点和SNP位点。检测条件简述如下：以10μL为反应体积，取1μL(10ng)DNA为模板，5μL 2×PCR反应液，0.2μL TaqMan-MGB探针及引物，余下用DEPC处理水补足。结果以双探针(VIC或FAM)的荧光信号判定。

统计学分析：采用SAS 9.3软件进行统计分析。病例与对照在性别、年龄、全身病等方面是否有差异采用t检验和卡方检验。对组内SNP分布行哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE)检验；在加性模型(additive model，AM)，显性模型(dominant model，DM)和隐性模型(recessive model，RM)下用Logistic回归分析SNP与PAC的关系，计算优势比(odds ratio，OR)，95%可信区间(95%condidence interval，95%CI)。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 HWE平衡检验基因分型检出率为98.5%，其中对照组98.0%(300/306)，病例组99.1%(230/232)。对照组的HWE平衡检验，χ2=0.73，P>0.05；病例组的HWE检验，χ2=0.26，P>0.05，两组均符合HWE平衡。

2.2两组的基因型分布及等位基因频率PAC组与对照组的基因型分布及等位基因频率见表2，两组之间差异无统计学意义。

3讨论

PACG是一种由于前房结构拥挤，导致前房角关闭、房水流出受阻，进而引起眼压升高、视神经损害的疾病。PACG的病因和发病机制尚不甚明确，目前多认为是一种多因素、多基因疾病[12]。浅前房是PACG最大的危险因素[13]，但目前无法预测浅前房是否会发生前房角关闭，以及何时会发生前房角关闭。

表2两组的基因型和等位基因频率比较

rs6759535基因型分布(例,%)对照组PAC组χ2POR(95%CI)等位基因C509(84.8)379(82.4)1.1420.2851.20(0.84～1.66)T91(15.2)81(17.6)基因型CC214(71.3)155(67.4)1.2610.53DM=1.20(0.83～1.75)CT81(27.0)69(30.0)0.9570.33RM=1.58(0.48～5.25)TT5(1.7)6(2.6)0.5690.45

rs1157699位于CRLR基因的第一内含子区域，可能对基因的表达起调控作用。该序列变异可能导致CRLR过表达，进而导致肾上腺髓质素(adrenomedullin, AM)介导的瞳孔括约肌松弛，瞳孔扩大，从而引起急性前房角关闭[5]。AM是存在于心、脑、肾、眼等多种组织的多肽，在血管内皮、血管平滑肌细胞、房水中可检测到其表达[14-15]。通过与受体活性修饰蛋白2(RAMP2)和CRLR结合而发生生物学效应[16]。AM具有舒张血管，降低炎性渗出，降低内皮细胞通透性的作用，从而具有保护心脑肾免受感染性休克、缺血和高血压的损伤，维护血流、增加组织抗氧化应激的能力[17]。刘杏等做了APACG(109例)，CPACG(98例)与CRLR的rs1157699的关联研究[6]，发现rs1157699与APACG可能相关，而与CPACG无关。在APACG组的基因型分布为CC 52.3%，CT 44%，TT 3.7%，在对照组的基因型分布为CC 67.3%，CT 29.3%，TT 3.4%，差异有统计学意义(P=0.024)，提示T等位基因可能是APACG的危险因素。但在多重矫正后失去了统计学意义(P=0.2)，我们认为有必要进行更大样本量和不同人群的验证。

本研究利用来自江苏省盐城阜宁县流行病学调查筛选出的PAC人群，对rs1157699与PAC的关系进行了关联研究。以流行病学人群为对象可以克服以医院患者为对象的诸多局限性，如选择性偏倚、回忆偏倚和对照组选择上的偏倚，因而具有良好的可信性和代表性。考虑到AM能增加组织血供，可能对视神经损伤有保护作用，本研究选取了PAC群体为研究对象，不包括已发生视神经损伤的PACG，这样可以更好地反映基因序列变异与房角关闭发生的关系，去除一些混杂因素的影响。我们的研究结果显示,PAC组的T等位基因频率高于对照组，与刘杏等的研究相似，但差异无统计学意义。我们未能验证刘杏等的结果[6]，可能有以下原因：(1)PACG系多因素疾病，其发病机制和遗传方式非常复杂，可能是多种基因序列变异的累积效应及环境因素共同作用的结果。对于与遗传有关的多因素疾病，由于每一个致病基因单独所起的作用较小，即使对与疾病高度相关的SNP，在不同的研究中也常常得不到验证[18]。另外，刘杏的研究对象为APACG，而我们的研究对象为PAC。结果的差异可能和疾病表型不同有关。由于我们阜宁流行病学中的PACG达不到关联分析所需要的样本量，本研究未做该位点与PACG的关联分析。CPACG的发生虽然较APACG复杂，但两者都具有共同的眼前节解剖特征，都是各种因素导致虹膜根部与房角相贴或粘连。

总之，我们的研究结果说明rs1157699与PAC之间无相关性。但也不能排除CRLR在原发性闭角型青光眼发病中的作用。有必要增加样本量，选取多基因多位点进行关联研究，进一步阐明PAC及PACG的发病机制。

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基金项目：江苏省卫生厅科技项目(No.H201424)

作者单位：(226001)中国江苏省南通市，南通大学附属医院眼科

作者简介：秦柏，毕业于南通大学，学士，技师，研究方向：眼科分子生物学。

通讯作者：石海红，毕业于南通医学院，硕士研究生，副主任医师，研究方向：青光眼发病机制.shihaihong2@163.com

收稿日期：2016-04-25 修回日期： 2016-07-04

Foundation item:Science and Technology Project of Department of Public Health in Jiangsu (No.H201424)

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.8.46

•KEYWORDS:primary angle closure; calcitonin receptor-like receptor gene;single nucleotide polymorphism; Han Chinese population

Association of the single nucleotide polymorphisms in the calcitonin receptor-like receptor gene with primary angle closure in a Han Chinese population

Bai Qin, Hai-Hong Shi, Rong-Rong Zhu, Jun-Fang Zhang, Mei Yang, Huai-Jin Guan

Abstract